据世界卫生组织国际癌症研究中心（International Agency for Research on Cancer,IARC）资料统计显示,2018年全球约有209万肺癌新发病例,约176万死亡病例,发病率以及死亡率均位居第一位,5年生存率仅为18%。其主要原因是早期肺癌缺少典型的临床症状,确诊时已经是中晚期,或者已出现转移,因此肺癌的早期诊断是减少死亡以及改善预后的关键因素。目前肺癌诊断的常用方法有影像学检查、痰脱落细胞学和支气管镜检,这些方法容易造成漏诊与误诊,且仪器价格昂贵。因此迫切需要寻找到新的早期肺癌诊断的生物标志物。传统的肺癌肿瘤标记物是由肿瘤细胞产生的正常细胞缺乏或含量极微的抗原性物质,可以用于肿瘤筛查、预后监测及治疗效果监测等,常见的肺癌标志物癌胚抗原（carcinoembryonic antigen,CEA）、细胞角蛋白19片段（cytokeratin 19 fragment,CYFRA21-1）、神经元特异性烯醇化酶（neuron-specific-enolase,NSE）、胃泌素释放前体（progastrin releasing peptide,Pro-GRP）、鳞状上皮细胞癌抗原（squamous cell carcinoma antigen,SCC）等已经广泛用于肺癌的诊断方面,但是还不能用于早期筛查方面。细胞因子（cytokine,CK）是免疫系统的重要组成部分,参与机体正常的免疫稳态,异常情况下也会成为一些疾病发生发展的重要介质,参与炎症与肿瘤的发生。炎症细胞因子是慢性炎症与肺癌之间的桥梁,通过检测细胞因子在血清中的表达水平,可以对肺癌早期诊断有一定的参考价值。循环肿瘤细胞（circulating tumor cells,CTCs）是指来源于肿瘤组织并进入外周血循环的肿瘤细胞,即使在肿瘤形成的早期阶段,大量肿瘤细胞也可能流入循环系统,因此CTCs可以作为肿瘤无创和实时监测的工具,同时也是肿瘤患者液体活检重要标志物之一。法国一项研究表明,在慢阻肺患者中CTCs可较LDCT提前4-5年发现早期肺癌患者。早期CTCs检测主要以单纯计数为主,近年来用二代测序（next generation sequencing,NGS）技术对CTCs进行单细胞测序,为CTCs的研究提供了新的利器。我们前期研究显示,LDCT联合CTCs检测可以提高早期肺癌筛查的准确率,对捕获到的CTCs细胞进行NGS分析发现KIT、SMARCB1、TP53、ERBB2、PDGFRA、CFS1R and FGFR1等基因突变。代谢组学是研究某一时刻下正在发生的生命活动。代谢组学作为基因组学与蛋白质组学的补充,可以对肿瘤发生发展过程中的所有代谢物进行定性和定量分析。研究代谢物的表达量,代谢物与生理病理变化的关系,有助于筛选肿瘤患者早期诊断的生物标志物。研究表明,基于LC-MS的代谢组学方法在非吸烟女性非小细胞肺癌患者的血清代谢组学发现了56种差异代谢物,代谢谱特征为能量代谢紊乱、氨基酸代谢紊乱和脂类代谢紊乱等。Musharraf等采用GC-MS技术对肺癌患者、慢性阻塞性肺疾病患者、健康吸烟者和健康不吸烟者的血浆进行分析发现,肺癌患者血浆中脂肪酸、葡萄糖水平较其他组均升高。而Ding等人的研究提示糖代谢紊乱可能与肺癌密切相关。上述研究通过代谢组学方法发现了肺癌糖代谢增强和脂肪代谢的减弱,发现了一些潜在肺癌的肿瘤标志物。因此通过代谢组学寻找肺癌早期诊断的生物标志物具有重要意义。在本研究中,我们利用联合检测早期非小细胞肺癌患者外周血循环肿瘤细胞、传统肿瘤标志物、细胞因子以提高早期非小细胞肺癌的诊断率,利用单细胞测序的方法检测早期非小细胞肺癌患者外周血CTCs的突变基因,LC-MS非靶向代谢组学方法对早期非小细胞肺癌患者和健康对照者血清中代谢物质进行定性分析,通过分析探究早期非小细胞肺癌患者基因突变和代谢紊乱状态,将健康人与早期非小细胞肺癌患者很好的区分开,并从中探索早期非小细胞肺癌的生物学标志物。第一部分 循环肿瘤细胞与传统肿瘤标志物、细胞因子联合检测对早期非小细胞肺癌诊断的意义目的:探讨循环肿瘤细胞（CTCs）与传统肿瘤标志物、细胞因子联合检测在非小细胞肺癌早期诊断中的价值。方法:将2018-2019年首次在河北医科大学第四医院胸外科住院手术后确诊的48例早期非小细胞肺癌患者作为病例组,50例健康体检者作为对照组,分别检测两组人群外周血循环肿瘤细胞计数、肿瘤标志物及细胞因子。1.本实验通过采用新型CTCs捕获装置Cell Collector对早期非小细胞肺癌患者和健康人外周血CTCs进行捕获富集,应用免疫荧光技术进行检测鉴定。2.利用罗氏cobas e 801全自动化学发光免疫分析仪检测早期非小细胞肺癌患者与健康人外周血清肿瘤标志物癌胚抗原（carcinoembryonic antigen,CEA）、细胞角蛋白19片段（cytokeratin 19 fragment,CYFRA21-1）、神经元特异性烯醇化酶（neuron-specific-enolase,NSE）、胃泌素释放前体（progastrin releasing peptide,Pro-GRP）、鳞状上皮细胞癌抗原（squamous cell carcinoma antigen,SCC）水平。3.利用贝克曼NAVIOS流式细胞仪微球阵列术检测早期非小细胞肺癌患者和健康人外周血清中细胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-a、INF-g和IL-17A水平。4.利用受试者工作曲线（ROC）分析各指标单独检测与联合检测对早期非小细胞肺癌诊断价值,应用logistic回归分析比较联合肿瘤标记物检测和单独肿瘤标记物检测的灵敏度和特异度。所有数据采用SPSS 22.0软件进行统计分析,P<0.05为差异有统计学意义。结果:1.早期非小细胞肺癌患者外周血中的CTCs计数水平明显高于健康人,其计数水平、PD-L1表达水平与年龄、性别、吸烟史、临床病理分期和肿瘤大小对CTCs和/或PD-L1表达均无统计学差异（P>0.05）。2.利用ROC曲线分析CTCs表达水平对于早期非小细胞肺癌患者的诊断效果,CTCs对早期肺癌诊断ROC曲线下面积（AUC）为0.813,诊断灵敏度为62.5%,CTCs表达率对早期非小细胞肺的诊断有统计学意。（P<0.01）3.早期非小细胞肺癌患者外周血肿瘤标志物单独检测,标志物CEA（P<0.001）、CYFAR21-1（P<0.1）、NSE（P<0.001）水平均高于健康人,差异均有统计学意义。其中NSE敏感度最高,CEA与CYFAR21-1具有较高特异度。4.通过Logistic回归模型拟合CEA、CYFAR21-1、NSE联合检测结果,建立回归诊断模型Logit（P）,联合三种CEA、CYFAR21-1、NSE肿瘤标志物检测诊断早期非小细胞肺癌的灵敏度可达77.08%,特异度为74.00%。5.CTCs计数与肿瘤标志物单独与联合检测的诊断效果比较,结果显示（CTCs+CEA）对早期非小细胞肺癌的诊断效果最好,灵敏度达87.5%,特异度达到82.0%。其次为多个肿瘤标志（CEA+CYFAR21-1+NSE）联合检测,其灵敏度为89.58%,特异度为74.00%。6.早期非小细胞肺癌患者与健康人外周血细胞因子水平比较显示,早期非小细胞肺癌患者与健康人IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-a和IL-17A水平差异有统计学意义。（P<0.05）进一步分析,IL-17A对早期非小细胞肺癌的诊断效果最好。7.CTCs联合IL-17A检测,诊断早期非小细胞肺癌的灵敏度91.67%,特异度为73.33%。8.CTCs联合CEA与IL-17A检测,诊断早期非小细胞肺癌的灵敏度95.83%,特异度为58.00%。小结:1.本研究采用新型CTCs捕获装置Cell Collector对循环肿瘤细胞进行体内富集,并应用免疫荧光法检测循环肿瘤细胞,证实该方法具有较高的灵敏性及特异性,可以应用于早期非小细胞肺癌的检测。2.肿瘤标志物检测在早期非小细胞肺癌的诊断中有一定的价值,CTCs联合传统肿瘤标志物可以提高早期非小细胞肺癌的检出率,CTCs联合CEA诊断效果最好。3.CTCs联合细胞因子IL-7A检测,其灵敏度与特异度均高于单独检测。4.CTCs联合血清肿瘤标志物和/或细胞因子检测可以明显提高早期非小细胞肺癌患者的诊断敏感度,对早期非小细胞肺癌的诊断具有潜在的临床价值。第二部分 早期非小细胞肺癌患者外周血循环肿瘤细胞基因突变的二代测序研究目的:利用二代测序技术检测质检合格的19例早期非小细胞肺癌患者外周血的CTCs,分析CTCs细胞的基因突变情况,探讨CTCs基因突变与早期非小细胞肺癌发生发展的关系,为早期非小细胞肺癌的筛查与诊断提供相应的分子标志物。方法:1.在早期非小细胞肺癌外周血CTCs收集完成后,根据染色试剂盒的说明对捕获的CTCs的细胞收集器进行染色和鉴定,并提供阴性对照（NK92细胞）和阳性对照（SK-BR-3细胞）,进行CD45（Exbio,克隆Mem-28-Alexa647）抗体,细胞角蛋白7/19/pan-CK抗体（Exbio Praha,克隆A53-B/A2-Alexa488）和PD-L1（克隆PD-L1,Abcam）抗体染色分析,随后用Hoechst33342（Sigma）进行核染色,鉴定肿瘤细胞。2.免疫荧光染色鉴定CTCs后,定位并剪切显微镜下CTCs区域。将取样针中的一小部分CTCs收集到PCR管中,采用MALBAC方法进行全基因组扩增。采用Qubit3.0和Nanodrop2000（Thermo Fisher）进行定量分析。结果:1.对19例早期非小细胞肺癌患者外周血CTCs进行二代测序,检测127个基因突变,早期非小细胞肺癌患者外周血CTCs基因突变比例大于50%的有94.7%。其中有4例患者外周血CTCs基因突变比例>70%,12例患者外周血CTCs基因突变比例在60%-70%之间,2例患者外周血CTCs基因突变比例在50%-60%之间,有1例患者外周血CTCs基因突变在50%以下。2.对19例早期非小细胞肺癌患者外周血CTCs基因突变频率进行分析,19例早期非小细胞肺癌患者外周血CTCs高频突变基因分别为NOTCH1、IGF2、EGFR、PTCH1、ARID1A。3.对19例早期非小细胞肺癌患者外周血CTCs进行二代测序,共检测到62个肺癌相关基因突变,检测到229个突变位点。统计分析高频突变基因发现,多位点突变频率最高的是TP53和ARID1A。4.二代测序结果显示,在早期非小细胞肺癌患者外周血CTCs基因突变中以TP53、NOTCH1、ARID1A、SMARCA4多位点基因突变频率较高,占所有突变位点的37.99%。5.二代测序结果显示,在早期非小细胞肺癌患者外周血CTCs基因突变中,TP53基因突变分别与ARID1A共突变11例,与NOTCH1共突变11例,与SMARCA4基因共突变9例,与ALK共突变8例,TP53基因突变与EGFR、ALK、CDKN2A等60个基因存在多基因共突变现象。结论:二代测序结果发现19例早期非小细胞肺癌患者外周血CTCs基因突变比例较高,高频突变基因分别为NOTCH1、IGF2、EGFR、PTCH1、ARID1A。这些基因突变是否可用于早期非小细胞肺癌筛查的分子标志物有待于进一步证实。小结:第二代测序结果显示19例早期肺癌患者外周血CTCs基因突变中有62个肺癌相关突变,其中TP53、NOTCH1、ARID1A和SMARCA4是与早期肺癌外周血CTCs基因相关的高频突变。而这些基因突变是否可以作为肺癌早期筛查的分子标志物,还有待进一步证实。第三部分 代谢组学多元分析在早期非小细胞肺癌诊断中的应用目的:研究早期非小细胞肺癌患者与健康人的代谢产物的差别,探讨LC-MS非靶向代谢组学技术寻找代谢差异物应用于早期肺小细胞肺癌诊断的价值。方法:1.临床样本收集,收集早期非小细胞肺癌患者及健康人血清,其中早期非小细胞肺癌CTCs阳性患者30例（均为I、II期腺癌）与健康对照30例,进行空腹采血。5毫升全血收集到一个无菌凝固BD真空血液收集管,立即颠倒混合5-8倍,在30-120分钟,4 C和离心机在4摄氏度10分钟,1300克和0.2-1毫升血清转移到1.5毫升EP管,保存在-80 C。与此同时,30名健康对照为空腹血液取样,采血与血清制备同肺癌组。2.用LC-MS非靶向代谢组学方法检测早期非小细胞肺癌和健康对照血清进行分析,采集血清样品100μL,采用400μL甲醇:乙腈（1:1,v/v）溶液提取代谢产物。将混合物旋涡30秒,在冰上超声10分钟,此步骤重复3次。样品在-20℃下放置30分钟。在4℃下13000 g离心15分钟后,将上清小心转移到样品瓶中进行LC-MS/MS分析。3.使用Uplc-Triple-Tof-Ms平台（AB SCIEX,USA）分析代谢产物。采用Exion LCTMAD系统（AB Sciex,USA）,ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（100 mm 2.1 mm内径,1.7μm;水域,米尔福德,美国）。流动相A为水（含0.1%甲酸）,流动相B为乙腈/异丙醇（1/1）（含0.1%甲酸）;流速为0.40m L/min,进样量为20μL,柱温为40。作为系统调整和质量控制过程的一部分,通过混合所有等体积的样品来制备复合质量控制样品（QC）。QC样品定期进样（每9个样品）,以监测分析的稳定性。QC样品的处理和测试方法与分析样品相同。最好是代表整个样本集,并监测分析的稳定性。4.UPLC-TOF/MS分析后,将原始数据导入Progenesis QI 2.3（Waters Corporation,Milford,USA）进行峰检测和比较。预处理结果生成了一个由保留时间（RT）、质量电荷比（m/z）值和峰值强度组成的数据矩阵。所有样本中至少有50%的代谢特征被保留。过滤后,估计某一特定代谢物最低代谢物值的一半。在这些特定样本中,代谢物水平低于定量下限,每个代谢物特征用总和归一化。采用QC样品进行数据质量控制（重复性）,删除质量控制样品的相对标准偏差（RSD）变量>30%,以得到最终的数据矩阵,供后续分析。5.非靶标代谢组学统计分析,通过与数据库（http://www.hmdb.ca/,https://metlin.scripps.edu/）匹配,最终得到代谢物列表和数据矩阵。采用主成分分析（PCA）和偏最小二乘判别分析（PLS-DA）,正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）分析差异代谢物。通过模型参数R2和Q2来评估模型的有效性,这两个参数分别为模型的可解释性和可预测性提供了信息,并避免了过度拟合的风险。采用OPLS-DA模型计算预测变量重要性（VIP）,进行差异代谢物分析,筛选标准是变量投影重要性（VIP）大于1.0且t检验结果P值<0.05。用于代谢物相关通路分析的数据库是京都基因和基因组百科全书（KEGG;http://www.genome.jp/kegg/）。6.采用SPSS 22.0软件对数据进行分析。计量数据采用均值标准差服从正态分布,不服从正态分布的采用中位数（四分位数）,计数数据采用频率或率。正态分布计量资料比较采用t检验,非正态分布计量资料比较采用秩和检验。计数资料比较采用卡方检验。采用ROC曲线分析不同指标对肺癌的诊断效果。假定值P-values<0.05为显著性。结果:1.采用非靶标LC-MS检测将早期非小细胞肺癌患者（LC）和健康人（NC）血清样本进行正负离子模式全扫描,得到原始数据和图谱,血清LC-MS非靶向代谢组学检测方法根据美吉自主数据库分析鉴定血清样本的TIC,覆盖的所有主代谢通路的1212个代谢产物进行了检测分析,涵盖了31条主要代谢通路。2.对数据进行PCA分析,观察早期非小细胞肺癌与健康人的总体代谢差异和组内样本之间的差异度大小,PCA得分图结果显示早期非小细胞肺癌患者与健康人代谢物有明显差异。应用ropls Version1.6.2软件PCA对检测30例早期非小细胞肺癌患者和健康人样本的差异代谢物数据进行趋势分析,观察到早期非小细胞肺癌患者与健康人之间的变异度大小。PCA、PLS-DA、OPLS-DA得分图结果显示早期肺非小细胞癌患者与健康人样本可以很明显分开。因此考虑早期非小细胞肺癌与健康人个体内差异代谢物有明显不同。3.统计学分析发现组间含量有差异的代谢物共100个,应用ropls Version1.6.2软件中的PLS-DA、t检验（Student’s t-test）以及差异倍数分析法（FC）筛选能区别早期非小细胞肺癌患者和健康人的差异代谢特征。结合VIP>1,P<0.05及FC>1或FC<1,结果发现,两组样本之间存在100个差异有明显统计学意义的代谢特征。早期非小细胞肺癌患者差异代谢物最显著的涉及脂质物质,特别是鞘脂（如三己基神经酰胺）和甘油磷脂（如心磷脂）,它们是细胞膜的组成成分。4.筛选出的100个差异代谢物通过人类代谢组数据库（Human Metabolome Database,HMDB）分类为化合物,使用KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）数据库进行pathway注释和富集分析。我们筛选出了6种不同类型的代谢物,KEGG通路分析分为六类。通过KEGG富集的三个最重要的途径是癌症中的胆碱代谢、甘油磷脂代谢和逆行的内源性大麻素信号通路。5.肿瘤的发生发展与糖脂代谢密切相关,本研究中,通过KEGG通路分析,糖脂代谢通路和肿瘤代谢通路中富集的差异代谢物较多。21个差异代谢物涉及脂质代谢途径,5个差异代谢物涉及多糖合成和代谢途径,15个差异代谢物涉及肿瘤代谢途径,此为研究重点关注的通路。6.筛选早期NSCLC的潜在生物标志物,研究进一步比较了早期非小细胞肺癌患者与健康人之间脂质代谢途径、多糖合成和代谢途径以及肿瘤相关途径中的差异代谢物,并使用工作者受试曲线（ROC）和曲线下面积（AUC）,得出10个差异代谢物,3个上调,7个下调。小结:1.本次研究探索非靶标代谢组学研究早期非小细胞肺癌的辅助诊断标志物的方法。该种方法对标志物进行半定量分析,使筛选出的标志物具有可重复性,有效提高了其临床应用价值。2.早期非小细胞肺癌患者呈现出不同于健康人的代谢谱图特征,早期非小细胞肺癌患者多种代谢物的含量显著不同于健康人,这为进一步实验与临床研究提供了一定的参考依据,并为实现早期非小细胞肺癌的诊断提供一定的指导。3.通过我们的研究,得出10种差异种代谢物作为潜在早期NSCLC生物标志物,可用于辅助诊断,结果需要进一步靶向代谢组学技术进行验证。4.代谢组学多元分析得出差异代谢物主要集中在糖脂代谢通路特别是磷脂代谢通路,脂类代谢在早期非小细胞肺癌的发生发展中起到重要作用。我们提出该通路中的关键酶的可能作为新的治疗靶点用于今后的研究。