TNFα-TNFR1-NFκB调控癫痫发生中胶质细胞间相互作用的研究

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目的:研究KA诱导BV2小胶质细胞激活,利用其诱导星形胶质细胞观察TNFα-TNFR1-NFκB在癫痫神经炎症反应中的作用。方法:采用KA诱导的小胶质细胞癫痫模型,CCK8检测不同浓度KA对小胶质细胞活力的影响;ELISA检测KA刺激不同时间后TNF-α、IL-1β、IL-6的释放情况;Western blot检测小胶质细胞凋亡相关蛋白Caspase-3、Caspase-9和p53的表达水平;细胞钙成像检测小胶质细胞胞内钙离子含量的变化。提取小鼠原代星形胶质细胞,培养至第三代免疫荧光鉴定纯度后进行实验,将星形胶质细胞随机分为4组:正常小胶质细胞培养液(MCM)组、KA诱导的MCM组(KA-MCM)、TNF-α中和组以及TNFR1拮抗组。MCM组细胞给予正常小胶质细胞培养液处理6 h;KA-MCM组细胞则给予KA刺激的小胶质细胞培养液处理6 h;TNF-α中和组将KA-MCM预先用TNFα中和2 h后再培养星形胶质细胞;TNFR1拮抗组细胞预先给予星形胶质细胞TNFR1拮抗剂处理2 h,继而给予KA-MCM作用6 h。Western Blot检测星形胶质细胞NF-κB p65、p-NF-κB p65和IκBα蛋白的表达;细胞免疫荧光检测星形胶质细胞NF-κB p65核移位情况。结果:(1)KA体外诱导BV2小胶质细胞炎症反应并促进其凋亡CCK8结果显示,BV2小胶质细胞的活性随KA浓度的升高而逐渐下降。ELISA结果表明,TNF-α、IL-1β、IL-6的含量随KA刺激时间的延长呈时间依赖性增加。免疫印迹检测凋亡相关蛋白结果显示:与Control相比,KA组BV2小胶质细胞凋亡相关蛋白Caspase-3、Caspase-9和p53的表达明显升高(P<0.05)。钙成像检测BV2小胶质细胞胞内Ca2+水平,发现KA组BV2细胞内的Ca2+水平明显高于对照组(P<0.0001)。(2)TNFα-TNFR1调控小胶质细胞对星形胶质细胞的激活免疫印迹结果显示,与MCM组相比,KA-MCM组p-NF-κB p65蛋白磷酸化水平升高(P<0.001),IκBα蛋白表达降低(P<0.01),这种改变可以被TNF-α中和(p-NF-κB p65:P<0.05,IκBα:<0.01)和TNFR1拮抗(p-NF-κB p65:P<0.01;IκBα:P<0.001)所减弱。细胞免疫荧光结果显示,KA-MCM组NF-κB p65核移位水平增加,而TNF-α中和、TNFR1拮抗可逆转这种改变。结论:KA可以激活小胶质细胞并促进BV2小胶质细胞的凋亡从而发挥神经毒性作用。经KA激活的小胶质细胞培养液可激活星形胶质细胞,阻断二者间TNFα-TNFR1的作用可抑制胶质细胞间的级联炎症反应。
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