肌内脂肪(Intramuscularfat，IMF)是肉质细嫩多汁和口感好的物质基础，IMF含量的增加可以使肌肉嫩度、多汁性和肉色得到提高。目前在对猪肉质的评定指标中，肌内脂肪的含量已经成为肉质指标中最关键的参数。但自二十世纪七十年代以来，国内外在瘦肉型猪的选育中一直侧重于对瘦肉率的选择提高，高瘦肉率的选择导致瘦肉型猪IMF含量降到了1.5%左右，低于了最适范围，极大地降低了猪肉品质。如何能在保证瘦肉率的前提下提高IMF含量，已成为育种者研究的目标。PPARγ2在脂肪细胞分化，成熟中起着关键作用，研究表明，PPARγ2决定哺乳动物的体脂分布，与肌肉中的脂肪含量有关。因此，本研究以PPARγ2作为候选基因，构建了肌肉特异性真核表达载体，从细胞水平和转基因模型小鼠进行研究细胞或肌肉超表达PPARγ2的影响，期望发现肌肉超表达PPARγ2和IMF以及其他指标的关联，为培育高品质瘦肉猪建立转基因模型。取得的主要研究成果有：　　 1.以真核表达载体pEGFP-N1为框架，从猪MCK基因的BAC中采用基因抓捕技术，钓取了7Kb的MCK启动子序列，构建载体pEGFP-N1L-MCK，SalⅠ和NotⅠ进行双酶切，得到大片段pEGFP-N1L-MCK。以人工合成的PPARγ2 cDNA全长质粒(pMD-18-PPARγ2)为材料，分别用SalⅠ和NotⅠ进行双酶切，得到基因PPARγ2片段。将前面两部得到的大片段pEGFP-N1L-MCK和PPARγ2 cDNA进行连接，得到真核表达载体pEGFP-N1L-MCK-PPARγ2。通过载体部分测序，PCR检测，以及BglⅡ的酶切鉴定无误，说明真核表达载体pEGFP-N1L-MCK-PPARγ2构建成功。　　 2.以猪35日龄胚胎为材料，培养出原代成纤维细胞系，并将构建好的真核表达载体pEGFP-N1L-MCK-PPARγ2瞬时转染成纤维细胞和C2C12细胞，RT-PCR检测表明，PPARγ2能够在成纤维细胞和C2C12超表达，并且使脂肪合成相关基因SCD2、LPL、ACC等表达上调。同时，将线性化的载体转染小鼠的成肌细胞C2C12，经G418筛选，获得稳定转染的细胞株，PCR检测阳性，RT-PCR检测表明，阳性细胞PPARγ2较阴性细胞表达大幅增加。通过以上两种细胞转染实验可见MCK启动子能够带动PPARγ2在成纤维细胞和成肌细胞中超表达。　　 3.通过显微注射法得到阳性Founder小鼠5只，分别将阳性公母小鼠与阴性异性小鼠交配，生下F1代，对2周龄小鼠采用PCR技术检测出阳性小鼠。通过RT-PCR和Western Blot检测发现PPARγ2在阳性小鼠骨骼肌和心肌高表达，肝脏，肾脏中等，脂肪，小肠，睾丸等表达量很少，这一结果与MCK在哺乳动物不同组织的表达相符，表明我们构建的真核表达载体能够在转基因小鼠中正常表达，也表明猪MCK启动子和小鼠MCK启动子一样，能够驱动基因在肌肉组织中超表达。　　 4.我们对骨骼肌中脂肪合成，转运等相关基因通过Real Time PCR对mRNA检测发现脂肪相关基因表达得到不同程度的增加，如脂肪酸结合蛋白(FABP4)mRNA增加13倍，脂蛋白酯酶(LPL)增加1倍，DGAT1增加51%，脂肪酸合成酶(FAS)增加1.1倍，而能够降解脂肪的激素敏感脂肪酶(HSL)降低了62%。同时也发现SCD2表达减少。通过连续测定小鼠4-16周体重显示，转基因阳性小鼠体重与阴性小鼠差异不显著。通过对肌肉中甘油三酯的测定，阳性小鼠骨骼肌甘油三酯增加30%(p<0.01)，游离脂肪酸增加16%(p<0.01)，而血液中甘油三酯和血糖均差异不显著。我们对肌肉组织中脂肪酸组成进行了气相色谱测定，发现多不饱和脂肪酸C18:2、C20:4、C22:6增加，达到差异极显著水平。C16:1增加(P<0.01)而C18:1减少(P<0.01)。实验还对骨骼肌糖代谢相关基因进行检测，发现，葡萄糖转运蛋白1(Glutl)，葡萄糖转运蛋白4(Glut4)，磷酸葡萄糖异构酶(glucose phosphate isomerase1)，果糖二磷酸酶(fructose bisphosphatase2)，丙酮酸脱氢酶激酶1(pyruvate dehydrogenasekinase isoenzymel)等表达量增加，磷酸变位酶(phosphoglycerate mutase1)表达减少，糖元合成酶(glycogen synthase2)差异不显著。　　 5.在试验中，对皮下脂肪和肌肉中的棕色脂肪相关基因进行检测，发现皮下脂肪中棕色脂肪特意基因UCP1无论在mRNA水平(157fold，P<0.01)，还是蛋白水平，都提高很多倍，另一个棕色脂肪基因PRDM16也增加了79%(P<0.01)，另外PGC1α(2.2fold，P<0.01)、Cidea(21fold，P<0.01)、Cox7a(7.4fold，P<0.01)都不同程度的增加，且达到极显著水平。　　 6.实验对肝脏脂肪相关基因进行了检测，发现肝脏中PPARγ2增加8倍多，FAS增加210倍，DGAT1增加了93%，而HSL降低到了13%，FABP4增加了1倍多，说明肝脏合成多的脂肪酸和甘油三酯被转运到了其他组织，这与肝脏组织切片的HE染色结果一直，肝脏中脂肪变化差异不显著。