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小麦矮缩病毒(Wheat dwarf virus, WDV)是双生病毒科玉米线条病毒属的成员,由条沙叶蝉(Psammotettix striatus)传播危害。该病于2007年在我国陕西韩城大面积爆发,目前已在我国小麦产区造成严重危害。为了探明WDV的致病机理,本论文鉴定了WDV编码的致病因子并初步解析了其作用机制。本研究分别克隆了WDV的V1、 V2、 Rep A和Rep四个基因,将其构建到PVX表达载体PGR106上,利用农杆菌浸润法接种本氏烟后,症状观察显示只有含有Rep的PVX重组表达载体(PVX-Rep)在本氏烟接种叶诱导叶片出现黄化、皱缩和坏死斑,接种后期出现系统坏死和植株矮化症状。进一步对Rep进行无义突变并构建重组表达PVX-RepUT,浸润接种本氏烟后只能诱导接种叶和系统叶片出现花叶症状。ELISA和Western blot分析表明,PVX-Rep浸润接种9天、12天和15天后本氏烟叶片中PVX的病毒含量相比浸润PGR106空载体对照和PVX-RepUT的叶片明显降低,表明在本氏烟上引起的严重坏死是由Rep蛋白表达导致的。对Rep基因的突变分析表明,Rep蛋白的N端是致病的关键区,而Rep蛋白的C端对于致病性的影响并非关键。利用农杆菌共浸润转GFP基因的16c本氏烟,发现WDV编码的4个蛋白中只有Rep能抑制GFP基因诱导的局部沉默,浸润3天后在紫外灯下观察发现浸润区有明显的绿色荧光,Northern blot分析证实Rep和GFP共浸润转GFP基因本氏烟3天后GFP mRNA的积累量明显增加,表明WDV编码的Rep蛋白是RNA沉默的抑制子。进一步利用农杆菌浸润实验发现Rep能抑制GFP基因系统沉默信号的传导,还具有抑制GFP16c本氏烟GFP基因系统沉默的功能。对Rep突变体的分析发现,Rep蛋白的N端和C端都不是抑制基因沉默所必需的。进一步的电泳迁移率变动试验(EMSA)表明,Rep蛋白能与21nt和24nt的单、双链siRNA结合,且结合能力随着蛋白浓度的增加而增强,但结合单链siRNA的能力明显强于双链,说明Rep蛋白作为抑制子可能是通过与siRNA的结合而阻止沉默复合体(RISC)的形成而起作用的。