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共轭亚油酸(Conjugated linoleic acid,CLA)是具有共轭双键的十八碳二烯酸,具有抗癌、抗动脉粥样硬化和降脂等生理功效。植物乳杆菌可以转化亚油酸(Linoleic acid,LA)生成CLA,此过程需要脂肪酸水合酶(Fatty acid hydratase,CLA-HY)、羟基脂肪酸脱氢酶(Hydroxy fatty acid dehydrogenase,CLA-DH)和乙酰乙酸脱羧酶(Acetoacetate decarboxylase,CLA-DC)共同参与。所以,CLA-DH 是酶法生产 CLA的瓶颈之一。本实验对植物乳杆菌p-8的CLA-DH进行了基因克隆、原核表达、生物信息学分析和酶学性质研究,得到以下结果:(1)以植物乳杆菌p-8的基因组为模板扩增出CLA-DH,构建pET-28a-CLA-DH,转化入E.col Trans1-T1,经菌落PCR、酶切和序列分析说明原核表达载体构建成功。(2)通过对CLA-DH的生物信息学分析发现,CLA-DH为同亚基六聚体,属于典型的SDR超家族成员,具有Rossman折叠的典型保守结构,其N端存在辅酶结合位点的特征序列G-x-x-x-G-x-G,在140～160位氨基酸残基之间存在保守的催化活性位点的特征序列S-xn-Y-x-x-x-K。CLA-DH含286个氨基酸,是稳定的水溶性的胞质蛋白,无跨膜区和信号肽。其分子质量为32.0918 kDa,等电点为5.15,不稳定指数为25.53,平均亲水性(GRAVY)为-0.179。(3)将pET-28a-CLA-DH转化入E.coli Transetta(DE3),经IPTG诱导表达,Western Blot证明重组酶CLA-DH成功表达。(4)为提高可溶性CLA-DH的表达量,研究了诱导温度、诱导剂浓度和诱导时间对可溶性CLA-DH的表达量的影响,结果表明在诱导温度为16℃,IPTG终浓度为0.5 mmol/L,诱导时间为12 h的条件下可溶性CLA-DH的表达量最高。(5)对CLA-DH进行纯化浓缩,得到电泳均一性和含量较高的CLA-DH。以蓖麻油酸为底物对其酶学性质进行研究,发现CLA-DH最适温度为45℃,在20℃能保持一定的稳定性。最适pH为6～7,在此范围内稳定性较好。Mg2+、Mn2+、Fe3+可以提高酶活力,Cu2+、Zn2+、Fe2+会抑制酶活力,Vmax是1.04μmol/L·min,Km值是6.72 mmol/L,kcat 值是 3.3 6 min-1。