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丙氨酸氨基转移酶(Alanine aminotransferase, ALT)是一种参与人体蛋白质新陈代谢的酶,在葡萄糖和氨基酸代谢中起着关键的调节作用。临床上,血清ALT的测定主要用于肝脏疾病的早期筛查、诊断、治疗及预后的评价。本实验克隆、表达人丙氨酸氨基转移酶基因altl。通过RT-PCR从肝癌细胞中扩增丙氨酸氨基转移酶基因alt1,并将其克隆至pET-28a(+)表达载体中。将重组表达质粒pET28a-His-ALT1转化大肠杆菌BL21,经1.0mmol/L IPTG诱导,表达可溶性重组融合蛋白His-ALT1。通过硫酸铵沉淀、镍离子柱亲和层析及QHP柱层析三步纯化重组His-ALT1蛋白,并检测融合蛋白活性及稳定性,同时制备His-ALT1蛋白冻干粉。纯化后目的蛋白纯度达85%,经测定重组蛋白具有很高的丙氨酸氨基转移酶活性(200U/mg),所制备的His-ALT1冻干粉经热稳定试验表明稳定性良好。取纯化后的His-ALT1融合蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,应用淋巴细胞杂交瘤技术,制备小鼠源性抗人ALT1 McAb。用间接ELISA方法筛选出阳性杂交瘤细胞株,用有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行亚克隆。并制备单抗腹水,以QHP柱纯化单抗。通过过碘酸钠法以HRP标记纯化后的单抗,以Dot-blot法检测各株单抗特异性,以Dot-blot;法联合Western Blot法和阻断ELISA法进行各单抗识别抗原表位的鉴定,并以间接ELISA法分析各单抗的亲和力。用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液,并制备了稳定的金标记011-3抗体,与011-8单抗组合,利用双抗体夹心免疫胶体金测定法检测人血清ALT1。用杂交瘤技术制备出十四株能稳定分泌抗人ALT1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为011-1、011-2至011-14。十四株单抗具有良好的特异性。Dot-blot与Western Blot结果表明：011-1、011-2、011-4、011-7、011-8、011-9、011-10七株单抗识别抗原构象表位,而011-3、011-5、011-6、011-11、011-12、011-13、011-14七株单抗识别抗原线型表位。阻断ELISA法测定结果为：011-3、011-5和011-13识别相同或相近的抗原表位；而其他十一株单抗相互之间不存在阻断现象,该十一株单抗识别不同的抗原表位。间接ELISA法检测十四株单抗的亲和力大小为：011-10>011-3=011-5>011-11>011.1>011-2>011-13>011-12>011-4>011-6=011-8>011-14>011-9>011-7。011-8单抗与金标记011-3单抗组合,利用双抗体夹心免疫胶体金法检测血清ALT1,检测结果与生化全自动分析仪测定结果存在差异。