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棉花是中国重要的经济作物,在国民经济和社会发展中占有重要地位。早衰和非生物胁迫是限制棉花产量和品质的重要因素。WRKY转录因子在植物叶片衰老和非生物胁迫反应中发挥着重要的作用,但是参与调控棉花叶片衰老和非生物胁迫的WRKY转录因子知之甚少。前人对棉花WRKY转录因子进行了全基因组鉴定与分析,结合叶片衰老转录组和各种胁迫处理表达谱数据,筛选到在叶片衰老和非生物胁迫中上调表达的GhWRKY27/42/91基因。本研究旨在从棉花中克隆得到GhWRKY27/42/91基因并分析其功能,主要内容和结论如下:1.衰老上调表达的GhWRKY27基因的过表达转基因拟南芥衰老提前,叶绿素含量降低,衰老相关基因表达升高。转录激活试验表明GhWRKY27没有自激活活性。酵母双杂交文库筛选到67个GhWRKY27的潜在互作蛋白,酵母双杂交和双分子荧光互补试验表明GhWRKY27与潜在互作蛋白MYB转录因子GhTT2相互作用。酵母单杂交和凝胶阻滞电泳结果显示GhWRKY27可以直接结合细胞色素P450 94C1(GhCYP94C1)和成熟相关蛋白2(GhRipen2-2)的启动子并在双荧光素酶报告系统中激活它们的表达。此外,进一步分析了GhTT2、GhCYP94C1和GhRipen2-2在叶片衰老不同阶段的表达模式。2.从陆地棉CCRI10中克隆了GhWRKY42基因,多序列比对和进化分析表明GhWRKY42属于IId亚家族。荧光定量结果显示GhWRKY42基因在根茎叶中优势表达,在叶片衰老中上调表达,并受非生物胁迫ABA、MeJA、PEG6000和NaCl诱导表达。转录激活试验表明GhWRKY42不具有转录激活活性。β-葡萄糖醛酸酶(GUS)活性分析表明,GWRKY42启动子在烟草中表现出片段缺失活性,主要在ProGhWRKY42::GUS转基因拟南芥的根茎叶组织和甘露醇、MeJA处理的幼苗中表达。GhWRKY42在转基因拟南芥中过表达导致早衰表型,同时衰老叶片比例升高、叶绿素含量降低、衰老相关基因和ABA响应基因表达升高。GhWRKY42的VIGS棉花株高降低。3.从陆地棉CCRI10中克隆了GhWRKY91基因,对其基因结构、氨基酸序列和进化树进行了进行。荧光定量显示GhWRKY91基因在叶片、雌蕊、花瓣和萼片中优势表达;受叶片衰老诱导表达并且在早衰品种中的表达高于不早衰品种;受ABA和PEG6000处理下调表达。转录激活试验表明GhWRKY91具有转录激活活性。启动子转基因拟南芥的根茎叶GUS活性较强,ABA和干旱处理后GUS活性降低。GhWRKY91过表达转基因拟南芥植株幼苗变小、延缓自然衰老以及干旱诱导的衰老,提高了抗旱性,同时转基因拟南芥中衰老相关基因表达下调,胁迫相关基因表达上调。GhWRKY91的VIGS棉花降低了抗旱性。酵母单杂和凝胶阻滞电泳表明GhWRKY91结合GhWRKY17基因启动子,并在双荧光素酶报告系统中激活GhWRKY17的表达。