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[背景和目的]肺动脉高压（pulmonary arterial hypertension,PAH）是由各种原因引起的肺动脉压力增高,以肺血管重塑为病理特征的恶性肺血管疾病,最终因右心功能衰竭导致死亡。美国国立卫生研究院对特发性和家族性肺动脉高压患者的注册登记研究显示经传统治疗方法治疗的患者中位生存期仅为2.8年,随着对肺动脉高压发病机制认识的不断深入,临床医生诊断意识的提高及靶向治疗药物的研发与推广使用,患者生存率有了明显提高,但明确诊断患者的3年生存率仍很低（54.9%）。PAH涉及心内科、心外科、呼吸科、风湿免疫科、重症监护科及儿科等多个相关学科,其诊断困难、治疗棘手;目前PAH研究已成为全球研究的热点、难点。肺血管的持续收缩以及肺血管重构是PAH的主要病理生理学特点,现有PAH治疗方案仅能舒张血管,改善肺血流动力学,延缓右心功能衰竭,不能逆转肺血管的重构,阻止PAH病程的进展。近年来研究表明肺动脉内皮细胞（pulmonary arterial endothelial cells,PAECs）的损伤和功能障碍参与了 PAH的发生、发展过程,与肺血管重构密切相关,是PAH发生的早期事件。PAECs衬于肺动脉内表面形成血管内膜,是肺血管对各种应激因素的"感受器"。在PAH中,PAECs能分泌各种细胞因子,与多种细胞进行crosstalk参与肺血管的重构。因此,着眼于保护PAECs功能是防止PAH进展的有效策略。内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）是内皮细胞（endothelial cells,ECs）的前体细胞,它能分化为成熟的ECs并替换损伤或凋亡的ECs从而维持血管内膜的完整性。在PAH患者和动物模型中均发现循环EPCs数量下降和功能障碍,研究发现通过外周静脉移植EPCs能有效逆转PAH肺血管重构。因而通过改善EPCs的功能有可能促进PAH损伤血管内膜的修复、维持血管内膜的完整性能逆转肺血管重构、阻止PAH进展。ATP敏感性钾通道(ATP-sensitive potassium channel,KATP通道)是联系细胞代谢和电生理的钾离子通道,广泛分布于各种细胞和组织。它是由内向整流钾通道（inward rectifier potassium channel 6.x,Kir6.x）和磺酰脲类受体（sulfonylurea receptor,SUR）两类亚基组成。多种血管活性物质包括血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）,C 型钠尿肽（C-type natriuretic peptide,CNP）和硫化氢（hydrogen sulfide,H2S）能通过开放KATP 通道影响 ECs 功能。KATP 通道开放剂（ATP-sensitive potassium channel openers,KCOs）能促进ECs的增殖,迁移和血管形成功能、减轻低氧和野百合碱对PAECs的损伤。KATP通道是否能通过调控EPCs的功能来促进损伤肺血管内皮的修复从而逆转肺血管重构尚需进一步探索。本文工作将首先明确KATP通道是否在人外周血EPCs表达及其KATP通道的亚基构成,并研究开放KATP通道是否能改善EPCs功能及其相关的机制,为基于调控循环EPCs功能的PAH治疗提供理论基础和实验依据。[方法]1.EPCs培养:分离健康志愿者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）,将取得的细胞置于EGM-2培养基,培养贴壁细胞12-28天获得具有高增殖能力,呈铺路石样的细胞。应用免疫荧光法检测细胞膜结合FITC-UEA-I和摄取Dil-acLDL的能力,检测细胞表面CD31及血管性血友病因子（vWF）表达。应用流式细胞仪检测细胞表面分子CD133、CD34和CD309（VEGFR-2）的表达。取传代至第3-8代细胞进行试验。2.用RT-PCR、Western blot方法从mRNA和蛋白水平检测EPCs是否表达KATP通道及其亚基构成。应用免疫荧光法进一步验证KAtP通道各亚基在EPCs的分布。3.分别用EdU增殖掺入法,Transwell小室以及血管形成实验检测KCOs尼可地尔（nicorandil,Nico）,埃他卡林（Iptakalim,Ipt）及KATP通道阻断剂格列苯脲（glibenclamide,Gli）对EPCs增殖、迁移和血管形成功能的影响。4.用Western blot方法检测开放KATP通道对EPCs胞内CaMKⅡ、Akt、eNOS磷酸化水平的影响。[结果]1.EPCs细胞鉴定:PBMCs贴壁生长12-28天后呈铺路石样生长并可传代继续培养。免疫荧光染色显示该细胞FITC-UEA-I和Dil-acLDL双染阳性,CD31及vWF表达均为阳性表达。流式细胞仪检测结果为CD309、CD34、CD133的表达阳性率分别为99.5%,3%,0.6%。实验表明此细胞为:内皮集落形成细胞（endothelial colony-forming cells,ECFCs）即晚期EPCs2.KATP通道在ECFCs的表达:RT-PCR、Western blot研究表明KATP通道表达于ECFCs,其亚基的构成为Kir6.1、Kir6.2和SUR2b。免疫荧光研究发现Kir6.1、Kir6.2和SUR2b在ECFCs的细胞膜和细胞质内均有存在。3.KCOs对ECFCs增殖、迁移和血管形成功能的影响:Nico和Ipt均能浓度依赖性增强ECFCs的增殖,迁移,血管形成能力,这一效应可被KATP通道阻断剂Gli阻断。4.Nico和Ipt能够促进ECFCs内CaMKⅡ、Akt、eNOS的磷酸化且这种效应能被Gli取消。单独使用Gli对ECFCs内p-CaMKⅡ、p-Akt、p-eNOS无显著影响。[结论]1.ECFCs表达Kir6.1、Kir6.2及SUR2b构成的KATP通道。2.KCOs能促进ECFCs增殖,迁移,血管形成能力。这一效应与KATP通道开放后细胞内Ca2+/Akt/eNOS信号通路活化相关。3.KATP通道是调节ECFCs功能新靶点,开放KATP通道可能在PAH早期因改善ECFCs的功能促进损伤肺血管内皮的修复从而阻止疾病进一步发展,为临床治疗PAH提供了新的治疗思路。