植物细菌性青枯病(bacterial wilt of plants)是由茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum Yabuuchi et al.,简称青枯菌)引起的一种重要土传病害。国内外研究表明,青枯菌在胁迫条件下可进入活的非可培养状态(viable but non-culturable,VBNC)。虽然国内外已在硫酸铜、低温、高温诱导青枯菌VBNC状态以及青枯菌VBNC检测方面取得进展,但尚未解析转录调控因子RpoS与青枯菌VBNC的联系以及在致病进程中发挥的作用,也未建立适用青枯菌所有小种的PMA-qPCR检测体系。本研究以青枯菌生姜分离菌株Z-Aq-1(以下简称Aq菌株)为研究对象,采用生物信息学、植物病理学、分子生物学和反向遗传学等研究手段,构建精准高效的青枯菌活细胞检测技术体系,探明青枯菌VBNC状态形成与复苏的诱导因子,解析转录调控因子RpoS与青枯菌可培养/非可培养状态间转换、致病性等生物学表型间的内在关联。旨在为病害早期诊断及病害流行学规律研究提供技术支撑,为揭示VBNC状态在青枯病侵染循环中的作用提供科学依据。1.PMA-qPCR定量检测青枯活菌方法的建立通过单因素变化试验对叠氮溴化丙锭(PMA)预处理体系中的各参数进行优化,确立了PMA预处理体系,PMA终浓度15 ng/μL,黑暗孵育时间10 min,曝光时间5 min。将PMA与qPCR相结合,建立了一种适于所有青枯菌小种5×10~2~5.0×10~8 cfu/mL范围内菌悬液活菌的检测方法。2.rpoS基因突变菌株和互补菌株的构建基于NCBI中青枯菌UY031的全基因组序列,以rpoS基因为研究对象,采用同源重组的方法成功构建rpoS基因突变载体及互补载体。通过自然转化及抗性筛选成功获得突变菌株Aq△rpoS,可能由于rpoS基因缺失的影响,通过自然转化和电击法均无法获得互补菌株。3.rpoS生物学表型功能验证致病力生物学测定结果表明,相比野生菌株具有强致病力,突变菌株完全丧失致病力。定殖试验结果表明,相比野生菌株在番茄根部和茎部定殖量高达10~100 cfu/g,突变菌株定殖能力显著下降,接种过程中始终维持在2×10~8 cfu/g水平以下。NB培养基中生长曲线结果显示,与野生菌株相比,突变菌株在对数生长期的生长速率显著减慢;而基础培养基中,突变菌株完全不能生长。Biolog代谢芯片测定结果表明,突变菌株与野生菌株在蔗糖、α-D-葡糖、果胶、D-果糖等几种重要碳源的代谢上存在明显差异。逆境胁迫生长测定结果表明,突变菌株在酸性和高渗透压条件下的生存能力均弱于野生菌株。耐药性测定结果显示,突变菌株对5种铜制剂的耐药性均弱于野生菌株。运动性和生物膜测定结果表明,突变菌株的运动能力和生物膜形成能力均强于野生菌株。4.青枯菌VBNC状态的诱导和接种复苏铜离子诱导结果表明,突变菌株比野生菌株更快进入VBNC状态。低温诱导结果表明,突变菌株比野生菌株提前60天进入VBNC状态。高温诱导结果表明,48℃处理30 min,突变菌株即可完全进入VBNC状态,而野生菌株需50℃处理30 min。接种番茄试验表明,以上3种方法诱导进入VBNC状态的野生菌株可在番茄组织内复苏,而野生菌株不能在番茄组织内复苏。