高产α-淀粉酶地衣芽孢杆菌的筛选及重组质粒的构建

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本研究以从白云边高温大曲中筛选得到16株嗜热芽孢杆菌为出发菌株,再从中进一步筛选出高产α-淀粉酶芽孢杆菌,并对其产酶特性进行研究。为了从分子水平上研究该菌的产香或产酶机制和构建该菌的突变体库,本课题构建了一个含有氨苄青霉素抗性基因转座子的质粒。主要研究结果如下:(1)通过淀粉-碘液平板法初步检测16株嗜热芽孢杆菌的α-淀粉酶酶活,筛选出产α-淀粉酶酶活较高的菌株,再通过改良的Yoo法进一步准确测定该菌株的α-淀粉酶酶活大小,通过最适酶反应温度测定得到该菌株产α-淀粉酶的最适反应温度为70℃,确定为高温α-淀粉酶生产菌株。通过观察产α-淀粉酶芽孢杆菌的菌落形态并结合其16S rDNA序列对比将该菌鉴定为地衣芽孢杆菌,并命名为BG14。(2)对产α-淀粉酶地衣芽孢杆菌BG14的酶活特性进行研究,由BG14的生长曲线和产酶曲线可见,0h~2h是菌株BG14的生长迟缓期,2h~18h为其对数生长期,在其生长至42h时产α-淀粉酶的活性达到最大。BG14产耐高温α-淀粉酶的最适pH值为7.5,最适培养温度为40℃,最适装液量为20%,最适转速为180rpm。对BG14发酵培养基进行正交实验得到的最优培养基为:黄豆粉0.7%,可溶性淀粉0.5%,麸皮1.0%,蛋白胨1.0%,K2HPO40.5%,pH7.0~7.5。耐高温α-淀粉酶活力达到334.32U/mL,比初始发酵培养基的酶活力提高43.09%.(3)利用BG14制备功能性强化麸曲模拟酒厂的固态发酵过程,通过基酒的理化指标测定结果可以看出加入BG14强化麸曲的基酒比普通基酒的出酒率高,总酸和总酯含量也较高。通过气相色谱分析可以看出加入BG14强化麸曲的基酒中与酱香型白酒风味成分相关的糠醛、异戊醛和β-苯乙醇含量比普通基酒高出很多。(4)经验证本实验室筛选的BG14对壮观霉素(Spc)敏感性不高,而对氨苄青霉素(Amp)非常敏感。本研究构建的重组质粒pMarA-4T-2载体有氨苄青霉素和红霉素双重耐受性,而高产α-淀粉酶BG14在氨苄青霉素高于50μg/mL时,耐受性极弱,不生长;在红霉素浓度高于25μg/mL时,则耐受性极弱,不生长。故在后续筛选中抗生素的浓度分别为氨苄青霉素50μg/mL、红霉素浓度25μg/mL。构建的重组质粒pMarA-4T-2能在E.coli/DH5α稳定复制和遗传,pMarA-4T-2可以用来研究BG14的产酶机理和突变体的构建。
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