盐胁迫是影响我国农业生产的一个重要因素,近年来,通过组成性表达植物 Na+/H+antiporter 基因,获得了耐盐能力显著提高的多种转基因植物,表明通过这种策略培育耐盐作物品种具有广阔的前景。但是目前关于果树植物 NHX 基因功能和转 NHX 基因果树植物的研究仍然是空白。本研究通过 SOEing 技术,将来源于果树植物(柑橘)的 Na+/H+antiporter 基因片段融合为一个完整基因,并利用多基因突变的酵母菌株分析了 cNHX1基因的细胞定位、离子区域化功能、离子特异性和对 1.5M NaCl 诱导的酵母细胞程序性死亡的抑制作用,证明 cNHX1 基因为具有功能的植物液泡膜 Na+/H+ antiporter 基因。同时本研究对转 cNHX1 基因的‘弗吉尼亚’草莓外源基因表达特点和整合情况及盐胁迫条件下某些生理指标的变化进行了研究,为利用 cNHX1 基因转化果树植物,获得耐盐的转基因植株做了初步尝试。主要结果如下: 1.根据测定的 cNHX1 基因 5ˊ和 3ˊ片段序列,按照 SOEing 方法的原则,设计了4 条引物,F01、F02、R01 和 R02。其中 F01 和 R01 从含有 cNHX1 基因 5ˊ序列的载体1 中扩增出约 500bp 的条带,引物 F02 和 R02 从含有 cNHX1 基因 3ˊ序列的载体 2 中扩增出约 1200bp 的条带。利用引物 F01 和 R02 从 500bp 和 1200bp 片段的混合物中扩增出1.63kb 的完整 cNHX1 基因。经序列测定表明,T1 质粒在 77 和 804bp 处发生由 T 变 C的突变,其中 77bp 的突变导致氨基酸序列的变化。利用酶切的方法将 T10 质粒相应片段置换 T1 质粒突变区域,从而修复了 cNHX1 基因的突变,首次获得完整的果树 NHX基因。 2.利用多种软件对 cNHX1 基因序列特征进行了分析。同源比较分析结果表明,cNHX1 基因与其它植物 NHX 基因高度同源;系统发生树的构建结果表明,cNHX1 基因与具有功能的 AtNHX1 和 2 关系较近,而与无功能的 AtNHX4 和 6 及 K+/H+ antiporter基因 LeNHX2 关系较远;结构域分析表明,cNHX1 蛋白在 26 至 449 残基之间含有完整的 Na+-H+ exchanger 结构域。Topology 模型分析表明 cNHX1 基因含有 9 个 TMs;细胞定位预测结果表明 cNHX1 蛋白是一种 IIIa 型膜蛋白,不含有任何已知定位信号。 3.首次利用双链 DNA 荧光染料 DAPI 特异性染色酵母细胞线粒体,结合分析 1<WP=13>魏振林: cNHX1 基因的融合、功能鉴定和对转基因草莓耐盐性影响的研究GEF1-GFP 和 cNHX1-GFP 融合蛋白发射的绿色荧光图象,分析了 cNHX1 蛋白在酵母细胞中的亚细胞定位。图象分析结果表明 cNHX1 蛋白没有定位于线粒体,而是位于液泡膜上。 4.利用模式培养物-酿酒酵母分析了 cNHX1 基因的离子区域化功能和离子特异性。将 cNHX1 基因克隆到酵母表达载体 pYX212 中,得到了 pYXNHX 载体,并通过电转化方式,将 pYXNHX 载体转化进酵母细胞菌株 AXT3K 中。分析了 50mM NaCl 胁迫条件下 W3031B、AXT3K 和表达 cNHX1 基因的 AXT3K 酵母细胞的生长曲线,结果表明盐胁迫对酵母细胞的生长有抑制作用,但是表达 cNHX1 基因的 AXT3K 细胞部分的缓解了这种抑制作用。利用 Drop assay 方法分析了 cNHX1 基因的离子区域化功能和离子特异性。结果表明在含有 50mM NaCl 的 YPD 培养基上,表达 cNHX1 基因的 AXT3K 细胞生长情况好于空白 AXT3K 细胞,在 1%的稀释浓度时,两者即表现出生长状况的差异,随着稀释浓度的加大,这种差异更加明显。同时,表达 cNHX1 基因的 AXT3K 细胞对10mg.L-1Hyg 的耐受性提高。测定了 50mM NaCl 胁迫条件下生长在 AP 培养基中酵母细胞 Na+和 K+含量,结果表明表达 cNHX1 基因,提高了胁迫条件下细胞的 Na+和 K+离子含量,证明 cNHX1 基因具有 Na+/H+ antiporter 活性。同时研究了 cNHX1 基因的离子特异性,结果表明 cNHX1 基因的离子特异性并非十分严格,除 Na+外,K+和 Li+也可以被cNHX1 基因转运到液泡膜而缓解了 1mM KCl 和 3mM LiCl 对酵母细胞的毒害性。 5.首次分析了 cNHX1 基因对 1.5M NaCl 诱导的酵母细胞程序性死亡的抑制作用,DAPI 染色的结果表明 cNHX1 基因部分的抑制了盐胁迫诱导的 PCD 过程,表现为减少了发生细胞核碎裂现象的比例,并延迟了进入细胞裂解期的时间。Clonigenic survivalassay 结果表明表达 cNHX1 基因的 AXT3K 细胞 CFU 值在所有的处理时间均高于空白AXT3K 细胞,证明 cNHX1 基因提高了酵母细胞在盐胁迫条件下的生活力和菌落形成能力。FACS 的分析结果也证实了 cNHX1 基因对 PCD 过程中 DNA 降解的抑制作用。 6.利用农杆菌方法,获得了转cNHX1基因的草莓植株,并首次利用Real Time PCR技术定量研究了不同转基因株系cNHX1基因表达水平和拷贝数。结果表明不同转基因株系的cNHX1基因表达水平存在差异,这种差异随盐胁迫处理时间的延长而加大。在所研究的株系中,T6株系有最高和最稳定的cNHX1基因表达水平,而T2株系的表达水平最低。对转基因植株基因组cNHX1基因含量的分析表明,T3、T6、T8和T14的含量相似,而与可T2株系相差289%-310%,通过与草莓基因组大小的初步数据比较,推测T3、T6、T8和T14株系为单拷贝植株,而T2株系为3