论文部分内容阅读
恶性肿瘤是目前危害人类健康的主要疾病之一。早期发现、早期诊断和早期治疗对肿瘤患者预后至关重要。肿瘤的诊断从定性到定量、定位已取得长足发展。甲胎蛋白（AFP）与癌胚抗原（CEA）等是非创性筛查及辅助诊断的代表性肿瘤标志物。但由于恶性肿瘤的形成是一个多因素、多阶段、多种生物学行为共同作用的结果，难以获得共同而单一的特异抗原，因此肿瘤血液诊断学研究仍是一个不断发展和认识的过程。肿瘤发生发展的过程中包含着活跃的蛋白质糖基化过程。IgG是血液中重要的糖蛋白。肿瘤患者外周血中是否存在着IgG的糖基化改变？若有，这种改变可用于肿瘤诊断吗？其对IgG功能的影响又如何呢？本研究通过大样本临床研究，对我国常见的消化系统恶性肿瘤（肝癌和大肠癌）中IgG N-糖基化修饰的特征性改变进行分析，建立并评价基于IgG N-糖组的诊断模型，旨在提高消化系统恶性肿瘤早期诊断的敏感性和特异性；根据疾病状态下的IgG N-糖组改变，对抗EGFR IgG1抗体（西妥昔）的CHO稳转细胞株进行相应糖基转移酶的调控，检测IgG N-糖组改变对其功能的影响。第一部分： IgG N-糖组在HBV相关原发性肝细胞癌中的诊断和预后价值研究本研究的目的是通过对HBV携带者、肝硬化、原发性肝细胞癌（HCC）和健康对照组IgG N-糖组图谱的分析，寻找可用于从HBV相关肝病或肝硬化中鉴别诊断HCC的IgGN-糖标志物，并用ROC曲线对其进行诊断效力评估。本研究共收集387例血清用于诊断模型的建立（n=150）及诊断模型的效力验证（4组，共n=237）。采用小扁豆凝集素(LCA)或蛋白A/G亲和层析柱与免疫比浊法相结合的方法进行血清核心岩藻糖基化IgG的定量测定。以基于DNA测序仪的荧光糖电泳法（DSA-FACE）进行IgG的N-糖组图谱分析。在建模组和四个验证组中对IgG N-糖的诊断效力进行评估。并在对55例HCC患者的36个月的术后随访研究中进一步评估IgG N-糖的预后价值。ELISA法检测四个肝癌细胞系培养上清的IgG水平，从而评价肿瘤细胞的IgG分泌能力。研究发现：在建模组中，血清IgG的核心岩藻糖基化水平（LCA-IgG/IgG×100%）具有比甲胎蛋白更好的诊断价值（正确率和灵敏度分别提高13%和25%以上）。多个独立的验证组进一步证实了LCA-IgG/IgG具有良好的HCC鉴别诊断效力（尤其是从肝硬化中鉴别诊断HCC）。血清IgG中LCA-IgG/IgG和Peak1（IgG中无半乳糖的核心岩藻糖基化的两天线糖链）丰度高的患者术后生存率更低。体外肝癌细胞系IgG测定证实了肝癌细胞可以分泌IgG。综上所述， LCA-IgG/IgG对现有HCC诊断标志物甲胎蛋白和甲胎蛋白异质体有很好的补充作用，有望成为全新的非创性的HCC诊断标志物；血清IgG中的LCA-IgG/IgG和Peak1丰度有较好的HCC预后价值。第二部分：大肠癌中血清IgG N-糖的诊断价值应用DSA-FACE法对大肠腺瘤(n=66)、大肠癌(n=97)和健康对照组（n=65）的N-糖组图谱进行分析，明确大肠癌中IgG N-糖的特征性改变。并在此基础上，建立基于IgG N-糖改变的大肠癌诊断模型。采用小扁豆凝集素(LCA)亲和层析柱与免疫比浊法相结合的方法进行血清核心岩藻糖基化IgG的定量测定。IgG N-糖组图谱结构分析发现，大肠癌患者血清IgG中存在多个糖链丰度的显著升高[无半乳糖的核心岩藻糖基化的两天线糖链Peak1，有或无双天线半乳糖基化的二等分乙酰葡糖胺基化的糖链(Peak2和Peak7）]；与健康对照相比，核心岩藻糖结构丰度总和（Sumfuc）在大肠腺瘤和大肠癌中均显著升高。基于IgG N-糖改变的大肠癌诊断模型研究发现：Log（P1+P2）的ROC曲线下面积为0.703。与CEA（临界值为2.92ng/ml）相比，Log（P1+P2）的敏感度提高了28%，准确率提高了7%；在术前-术后配对比较中，术后Log（P1+P2）明显下降。且其与大肠癌患者的术后生存时间成负相关（P<0.05）。因此，我们认为基于IgG N-糖的Log(P1+P2)可以成为潜在的大肠癌诊断指标。第三部分：糖基化修饰改变对抗EGFR抗体（西妥昔）功能的影响肿瘤发生发展的过程中包含着活跃的蛋白质糖基化过程。IgG是血液中重要的糖蛋白。该部分的目的是研究肿瘤中存在的IgG糖基化改变是否对IgG功能有影响。通过前两部分对HBV相关肝病（n=150）和大肠疾病（n=227）中血清IgG N-糖图谱的分析，发现大肠癌患者和肝硬化患者血清IgG中的二等分乙酰葡糖胺的糖链丰度较其相应的健康和疾病对照组均显著上升。为了检测二等分乙酰葡糖胺基化糖链丰度的升高对IgG功能的影响，我们对稳定表达抗EGFR的人鼠嵌合IgG1抗体（西妥昔）的CHO细胞株进行了二等分乙酰葡糖胺转移酶（β,1–4-N-acetylglucosaminyltransferase III，GnT-III)的共表达。DSA-FACE图谱分析发现： Gn-TIII可将二等分乙酰葡糖胺转运至西妥昔的N-糖链上，本研究获得的三株西妥昔CHO细胞株表达的西妥昔二等分乙酰葡糖胺基化呈现不同程度的增加(7.16%-41.39%)。通过细胞增殖实验检测各抗体Fab片段（通过与人细胞表面EGFR结合）对EGFR阳性细胞的杀伤能力。以健康人外周血淋巴细胞为效应细胞，通过检测细胞杀伤标志物乳酸脱氢酶来评价乙酰葡糖胺基化上调后各抗体的抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用（ADCC）。结果显示：西妥昔中二等分乙酰葡糖胺糖链丰度的增加，不仅可提高西妥昔Fab段介导的对EGFR阳性细胞的杀伤作用，还可显著提高其对EGFR阳性细胞的ADCC作用。