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目的:1、检测人巨细胞病毒HCMV在人胚肺成纤维细胞系MRC-5和胶质瘤细胞系U87MG中病毒复制水平及即刻早期基因的表达水平。2、对HCMV感染的MRC-5和U87MG细胞中与IE86有相互作用的蛋白进行鉴定,为探讨剪接因子与IE86的生物学功能及对病毒感染状态的影响提供线索。方法:1、用HCMV AD169(MOI=1)分别感染MRC-5和U87MG细胞,用倒置显微镜观察细胞形态的变化。2、用HCMV AD169(MOI=1)分别感染MRC-5细胞和U87MG细胞,分别在感染后的6、12、24、48、72h收集上清液,将上清液进行空斑定量实验检测病毒滴度。3、用HCMV AD169(MOI=1)分别感染MRC-5细胞和U87MG细胞,分别在感染后的0、6、12、24、48、72h提取细胞总RNA和总蛋白,RT-PCR检测HCMV即刻早期基因IE72、IE86的表达水平,Western Blot检测IE72、IE86蛋白的表达水平。4、免疫共沉淀分别提取HCMV AD169感染MRC-5、U87MG细胞后IE86免疫复合物,Western Blot和质谱分析鉴定该免疫复合物的成分。结果:1、HCMV感染MRC-5和U87MG细胞后观察细胞形态变化,MRC-5细胞在病毒感染的6h开始出现细胞由细长变粗圆的现象,而在U87MG细胞中,直到病毒感染的24h后,才出现CPE现象。2、HCMV感染MRC-5、U87MG后在不同时间点(1、2、3、4、5、6、7、8d)收集上清液,空斑定量实验检测病毒滴度。在MRC-5细胞中,病毒感染后4d上清液的孔可检测到空斑,并且随着感染时间延长空斑数量增多;在U87MG细胞中,加病毒后前5d上清液的孔未出现变化,6d可检测到空斑。病毒定量后发现MRC-5比U87MG细胞中病毒滴度高。3、RT-PCR和Western Blot检测结果显示,HCMV在MRC-5和U87MG中即刻早期基因IE72、IE86的转录和翻译水平不同,MRC-5细胞明显高于U87MG细胞(P<0.05),MRC-5细胞中IE86/IE72高于U87MG细胞(P<0.05)。4、IE86抗体分别与HCMV感染48h的MRC-5和U87MG细胞总蛋白进行免疫共沉淀,对照组以鼠Ig G进行免疫共沉淀,将免疫共沉淀复合物变性后经SDS-PAGE凝胶电泳及考马斯亮蓝染色后进行质谱分析、数据库搜索,得到与IE86有相互作用的剪接因子。在MRC-5细胞中,共鉴定宿主细胞编码的剪接相关蛋白25种,在U87MG细胞中,共鉴定到宿主细胞编码的剪接相关蛋白8种。结论:1、HCMV在MRC-5细胞中的复制水平及IE72、IE86的表达水平均高于U87MG细胞。2、在MRC-5细胞中,有25种剪接因子与IE86有相互作用,包括hn RNPA2B1、hn RNPA1、hn RNPM、hn RNPK、hn RNPH1、hn RNPC、hn RNPA0等;而在U87MG细胞中,有8种剪接因子与IE86有相互作用,分别为hn RNPA2B1、hn RNPA1、hn RNPM、hn RNPK、hn RNPH1、hn RNPC等。3、某些剪接因子与IE86的相互作用影响了IE m RNA的剪接,从而造成IE在MRC-5和U87MG细胞中的表达差异,进而影响了HCMV的感染状态。