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研究背景:急性髓细胞白血病(Acute Myeloid Leukemia,AML)是一种恶性克隆性血液系统疾病,成人中最常见的急性白血病类型之一。目前常用于AML的治疗方法为联合化疗和造血干细胞移植,但传统方法不仅具有明显的副作用,而且不能有效改善患者的5年以上生存率和完全缓解率,因此开发新的治疗方法迫在眉睫。过去20多年里,大量文献报道,白血病干细胞(Leukemia Stem Cells,LSCs)是AML发病和耐药的根源。由于LSCs是由正常造血干细胞(Hematopoietic Stem Cells,HSCs)衍变而来,所以和HSCs有着许多相似的生物学特性和表型。LSCs在体内具有维持自我更新和处于静止期的特点,是其能够躲避化疗药物的杀伤,发生耐药性的重要起因。从AML患者样本分离出原代CD34~+CD38~-细胞群,进行异种移植实验,该群细胞在小鼠体内有很强的定植能力,证明LSCs和正常HSCs具有相似的免疫表型,但也为白血病的靶向治疗研究提供了难题。因此,有必要寻找出LSCs表面特异性标记,探索出能靶向杀伤LSCs而不损害HSCs的治疗方法。我们从大量临床样本中筛选出免疫球蛋白CD96在AML患者样本中高表达但在正常骨髓HSCs中低表达,根据CD96表达特点可进一步探究其能否成为AML靶向治疗的有效靶点。研究目的:研究CD96在AML发生发展过程中的作用机制。研究方法:利用TCGA、GSE24395数据库分析CD96表达与AML患者生存率之间的关系。设计shRNAs(shScramble、shCD96)构建慢病毒载体,转染至包装细胞293T使其产生慢病毒;慢病毒转染至U937和THP-1等AML细胞系,敲降CD96表达。转染后利用流式细胞仪分选出GFP阳性(GFP~+)的细胞。利用细胞计数方法计算GFP~+shScramble组和GFP~+shCD96组不同时间点的细胞数目,绘制细胞生长曲线;细胞克隆实验检测细胞克隆形成能力;细胞表面分化抗原抗体免疫染色法检测GFP~+shScramble组和GFP~+shCD96组细胞分化水平;瑞式-吉母萨染色检测GFP~+shScramble组和GFP~+shCD96组细胞向粒系-单核细胞的分化。分别将分选得到的GFP~+shScramble组和GFP~+shCD96组细胞通过小鼠眼窝静脉丛移植,15天后解剖小鼠,称量肝脏和脾脏质量,提取外周血、骨髓、肝脏和脾脏细胞,检测GFP~+细胞在小鼠外周血、骨髓、肝脏、脾脏等组织的定植情况。研究结果:通过数据库分析,与正常HSCs相比,CD96在AML患者LSCs中表达高出10倍左右。同时,CD96在AML各亚型中均有所表达,尤其在AML-M4和AML-M5亚型中表达量较高。利用shRNA敲降CD96,与GFP~+shScramble组细胞相比,GFP~+shCD96组细胞增殖率明显下降,细胞克隆数目减少,THP-1细胞CD11b抗原表达量升高,U937细胞CD19表达量上升。瑞式-吉母萨染色结果显示,GFP~+shCD96组细胞有向单核细胞-粒细胞形态学的转变。小鼠异种移植实验结果显示,GFP~+shScramble组小鼠肝脏、脾脏质量明显大于GFP~+shCD96组,且肝脏中GFP~+细胞百分率shCD96组比对照组shScramble明显降低。结论:CD96在AML患者中高表达,并在AML各亚型患者中表达具有普遍性,并且影响AML细胞增殖速率。CD96参与维持AML细胞的不完全分化状态,调控AML细胞在小鼠体内的定植。CD96可以作为AML靶向治疗的一个潜在靶标。