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Axin是1997年发现的小鼠Fused基因的编码产物,它在胚胎早期通过特异性抑制Wnt通路,而抑制胚胎体轴的形成,故得名Axin(axis inhibition)。Axin是一个支架蛋白,具有多个结合位点,可以与信号转导途径中多个成员结合构成复合物,在多条信号转导通路间发挥调节作用。随着研究的深入,Axin至少在Wnt,SAPK/JNK,TGF-β以及p53四种信号通路中发挥重要作用。其生物学功能涉及胚胎发育、神经元分化、肿瘤形成、细胞凋亡、糖原代谢等方面。特别是近年来,Axin作为肿瘤抑制因子,引起人们广泛的兴趣。已经在一些肿瘤中检测到Axin基因的突变,如肝细胞癌、结肠癌、髓母细胞瘤等。Axin过表达的转基因小鼠中出现不同组织器官大量细胞死亡,腺病毒感染野生型Axin基因到肿瘤细胞,可导致肿瘤细胞凋亡。我们实验室在人胶质瘤组织中检测到Axin基因第10个外显子发生错义突变,突变率为21.4%,其中DNA位点20801g-a(Genbank AE006463)突变例数最多。而后,我们又证实野生型Axin基因的表达可抑制胶质瘤细胞C6的增殖并诱导其凋亡。胶质瘤是神经系统常见的恶性肿瘤。原癌基因激活,抑癌基因失活是肿瘤产生、发展的主要原因,因此,研究抑癌基因Axin的突变是否影响了其抑制C6细胞增殖的功能以及是否与胶质瘤的发生发展相关,将有助于我们进一步探讨胶质瘤的发病机理。目的:研究突变型Axin基因对C6细胞增殖能力及细胞周期的影响,以期揭示突变型Axin基因在胶质瘤细胞C6中功能是否发生改变。方法:(1)用分子克隆技术,构建鼠突变型Axin基因真核表达载体pIRES2-EGFP-MT-Axin;(2)采用MTT比色法、平板集落形成实验方法及流式细胞仪测定细胞周期,观察细胞的增殖能力及细胞周期的变化;(3)采用免疫细胞化学方法观察Ki67、CyclinD1蛋白表达的改变。结果: ( 1 )成功构建了突变型Axin基因真核表达载体pIRES2-EGFP-MT-Axin,并建立了稳定表达突变型Axin基因的胶质瘤细胞C6细胞株。(2)通过MTT实验发现,转染突变型Axin基因与转染野生型Axin基因的C6细胞生长速度与转染空载体组相比均显著降低(P=0.043、P=0.032),野生型与突变型组间无显著差异(P=0.881)。(3)流式细胞仪检测细胞周期发现:C6、C6-Vector、C6-Vector-WT-Axin和C6-Vector-MT-Axin处于G1期比例分别为:60.9%、65.4%、75%、70.7%,处于S期的细胞比例分别为:27.2%、24.8%、18.9%和18.5%。C6-Vector-WT-Axin和C6-Vector-MT-Axin细胞均出现G1期被阻滞,S期比率下降。(4)细胞集落形成实验结果表明:C6、C6-Vector、C6-Vector-WT-Axin和C6-Vector-MT-Axin集落形成率分别为:39%、25%、7%和8%。转染野生型Axin细胞与转染突变型Axin细胞之间集落形成能力无差别(χ2=0.072,P=0.788)。(5)Ki67、cyclinD1阳性反应物均定位于细胞核,Ki67在转染野生型Axin与突变型Axin后的阳性表达率均显著低于转染空载体组(χ2值分别为40.737、53.592,P<0.01),而转染野生型与突变型Axin细胞间Ki67的表达无差别(χ2=2.918,P>0.01)。cyclinD1在转染野生型与突变型Axin基因的细胞中阳性表达率亦均显著低于转染空载体组(χ2值分别为55.730、22.523,P<0.01),而转染野生型Axin细胞与突变型Axin细胞间cyclinD1的表达无差别(χ2=5.703,P>0.01)。结论:突变型Axin基因明显抑制C6细胞的增殖能力,并且转染突变型Axin基因的细胞与转染野生型Axin基因的细胞,在细胞生长与增殖能力方面均显著降低,两者未见显著差别。因此,胶质瘤中发现的DNA位点20801g-a(Genbank AE006463)突变没有影响Axin基因抑制C6细胞增殖的功能。