病毒在非易感细胞或宿主中连续传代后,适应非易感细胞或宿主,同时在自然宿主中的毒力减弱,从而获得弱毒疫苗。猪瘟兔化弱毒疫苗（C株或HCLV株）是在20世纪50年代将猪瘟病毒强毒株在家兔体内连续传480余代获得的一株弱毒疫苗。与猪瘟强毒Shimen株相比,C株能够适应家兔,对猪无致病性。本实验室前期发现,E2蛋白是C株适应家兔的关键蛋白。那么,E2蛋白是如何介导C株适应家兔的?决定猪瘟病毒适应家兔的分子基础是否影响病毒在猪体内的毒力?为解析E2蛋白介导的C株适应家兔的分子机制,首先确定了C株适应家兔的E2蛋白关键氨基酸。以C株为骨架构建了包含Shimen株E2蛋白不同结构域的嵌合病毒,通过家兔接种试验发现位于E2蛋白Domain I是C株适应家兔的关键结构域。下一步,对Domain I中的差异氨基酸进一步分析,发现Domain I-2中的三个氨基酸位点（K105、P108和T109）能够决定C株对家兔的适应性。那么这三个位点中具体哪个氨基酸在C株适应家兔中发挥作用呢?因此,构建了单独突变和两两组合突变的突变体病毒,通过家兔接种试验发现,P108和T109是C株适应家兔的E2蛋白关键氨基酸。接下来,以不能适应家兔的嵌合病毒(vSM-HCLVE^rns)为骨架,构建了包含C株的E2^DomainI、E2^DomainII或E2^P108-T109的三株嵌合病毒来分析C株E2^P108-T109能否使vSM-HCLVE^rns适应家兔。家兔试验结果显示,E2^DomainI或E2^P108-T109而不是E2^DomainII能够使vSM-HCLVE^rns适应家兔,说明C株的E2^P108-T109与E^rns(E2^P108-T109-E^rns)能够赋予Shimen株适应家兔的能力。同时,我们发现家兔脾脏淋巴细胞是C株感染家兔脾脏的靶细胞。之后,将亲本病毒（Shimen株和C株）和嵌合病毒(vSM-HCLVE^rnsE2^DomainI、vSM-HCLVE^rnsE2^DomainII和vSME2^L108P-I109T-HCLVE^rns)感染分离的家兔原代脾脏淋巴细胞。结果显示,家兔适应毒(C株、vSM-HCLVE^rnsE2^DomainI和vSME2^L108P-I109T-HCLVE^rns)感染家兔原代脾脏淋巴细胞后随着时间的延长其基因组拷贝数逐渐增加,而家兔非适应株(Shimen株和vSME2^L108P-I109T-HCLVE^rns)的基因组拷贝数逐渐减少,进一步证明,C株的E2^P108-T109-E^rns能够赋予Shimen株感染家兔脾脏淋巴细胞的特性。同时,在原代猪巨噬细胞上分析亲本病毒和嵌合病毒的生长特性。结果表明,与亲本病毒Shimen株相比,嵌合病毒(vSM-HCLVE^rnsE2^DomainI、vSM-HCLVE^rnsE2^DomainII和vSME2^L108P-I109T-HCLVE^rns)在细胞内的基因组拷贝数无显著差异,而C株的基因组拷贝数在感染后24 h逐渐减少;而嵌合病毒在细胞上清中的毒价显著低于亲本病毒Shimen株在细胞上清中的毒价。由于E2糖蛋白与病毒侵入靶细胞和病毒嗜性有关,因此我们构建了基于亲本病毒和嵌合病毒的伪型病毒来分析C株E2^P108-T109-E^rns对病毒侵入家兔脾脏淋巴细胞的影响。结果证实,基于家兔适应毒的伪型病毒能够侵入家兔脾脏淋巴细胞,而以家兔非适应毒为模板的伪型病毒不能够侵入家兔脾脏淋巴细胞,说明C株E2^P108-T109-E^rns通过促进猪瘟病毒侵入家兔脾脏淋巴细胞来提高病毒对家兔的适应能力。然而,不同伪型病毒在侵入猪源SK6细胞时没有差异。最后,分析了关键氨基酸是否影响猪瘟病毒在猪体内的毒力。与强毒Shimen株相比,家兔适应毒(vSM-HCLVE^rnsE2^DomainI和vSME2^L108P-I109T-HCLVE^rns)的毒力未发生显著性改变,而家兔非适应毒(vSM-HCLVE^rnsE2^DomainII)的毒力减弱。综上所述,本研究发现C株E2^P108-T109-E^rns通过促进猪瘟病毒侵入家兔脾脏淋巴细胞进而赋予猪瘟病毒对家兔的适应性。同时,我们发现与适应家兔相关的C株E2^P108-T109-E^rns不影响猪瘟病毒在猪体内的毒力,而与适应家兔不相关的C株E2^DomainII-E^rns能使病毒的毒力减弱。本研究为决定猪瘟病毒适应家兔的分子基础和决定毒力减弱的分子基础之间的关系提供了重要信息,也说明猪瘟病毒弱毒疫苗的研发应该通过基因修饰而不是盲目传代。