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仔猪腹泻是生猪养殖场中常见的疾病，也是影响养猪业经济效益的重要因素之一，对其有效防治是目前关注和研究的重点。随着抗生素在养殖业中的广泛使用，多重耐药细菌不断出现，并可通过食物链将其耐药性传播给人类，对食品安全和公共卫生安全造成严重威胁。本研究以广东某生猪养殖场的腹泻和健康哺乳仔猪为研究对象，利用高通量测序技术分析腹泻仔猪与健康仔猪的粪便菌群差异，筛选出与仔猪腹泻相关的病原菌组成，再从采集的粪便样本中分离出致病菌，并采用纸片扩散法(K-B)对分离菌株进行17种抗生素敏感试验，最后对其中一株多重耐药肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)KP4进行全基因组测序。具体内容如下：
1、采用16SrRNA基因高通量测序技术对8份腹泻和8份健康哺乳仔猪的粪便样本进行测序，发现健康仔猪粪便菌群的多样性显著高于腹泻仔猪(P<0.05)；与健康仔猪粪便菌群组成相比，腹泻仔猪粪便中变形菌门(Proteobacteria)的相对丰度显著升高，而拟杆菌门(Bacteroidetes)显著降低(P＜0.05)；在属的分类水平上，腹泻仔猪粪便中埃希氏-志贺菌属(Escherichia-Shigella )、克雷伯氏菌属(Klebsiella )和乳杆菌属(Lactobacillus )的相对丰度显著高于健康仔猪，而拟杆菌属(Bacteroides )、Lachnoclostridium和瘤胃球菌属(Ruminococcus)显著低于健康仔猪(P＜0.05)。
2、从采集的16份仔猪粪便样本中共分离到33株大肠杆菌和3株肺炎克雷伯菌。其中肺炎克雷伯菌均为多重耐药菌，对复方新诺明、四环素、氟苯尼考、环丙沙星、恩诺沙星、庆大霉素、阿米卡星、头孢他啶、头孢噻肟和氨曲南等10种药物均有耐药性。大肠杆菌的多重耐药率为93.94%(31/33)，对复方新诺明、四环素和氟苯尼考的耐药率高于90%；对庆大霉素、环丙沙星、恩诺沙星和头孢噻肟的耐药率较高，分别为84.85%、69.70%、69.70%和45.45%；对氨曲南和阿米卡星的耐药率分别为15.15%和18.18%。所有分离菌株均对美罗培南、亚胺培南、头孢西丁、替加环素和多粘菌素敏感。
3、多重耐药肺炎克雷伯菌KP4的全基因组测序结果表明该菌株包含2个质粒基因组，通过数据库共注释到83个耐药基因和56个毒力基因，并发现该菌株可产CTX-M-27型超广谱-β内酰胺酶(ESBLs)，且耐药基因tet(A)、tet(R)、floR、dfrV、sul1、qacE、aadA16、aac(6)-Ib-cr、qnrB2、arr-6和blaCTX-M-27位于同一质粒上。KP4致病因子与I型菌毛、ECP黏附素、铁载体、血红素载体、生物被膜、外膜蛋白等有关，但rmpA、magA、wabG等与荚膜合成相关的基因缺失。
本研究分析了某生猪养殖场腹泻和健康哺乳仔猪粪便菌群的多样性和结构差异，并获得了与仔猪腹泻相关致病菌的耐药特征以及猪源多重耐药肺炎克雷伯菌的耐药机理、致病机制和遗传背景，为有效预防、治疗仔猪腹泻和兽医临床合理使用抗生素提供依据，同时为开发有效防治肺炎克雷伯菌感染的新方法奠定基础。
1、采用16SrRNA基因高通量测序技术对8份腹泻和8份健康哺乳仔猪的粪便样本进行测序，发现健康仔猪粪便菌群的多样性显著高于腹泻仔猪(P<0.05)；与健康仔猪粪便菌群组成相比，腹泻仔猪粪便中变形菌门(Proteobacteria)的相对丰度显著升高，而拟杆菌门(Bacteroidetes)显著降低(P＜0.05)；在属的分类水平上，腹泻仔猪粪便中埃希氏-志贺菌属(Escherichia-Shigella )、克雷伯氏菌属(Klebsiella )和乳杆菌属(Lactobacillus )的相对丰度显著高于健康仔猪，而拟杆菌属(Bacteroides )、Lachnoclostridium和瘤胃球菌属(Ruminococcus)显著低于健康仔猪(P＜0.05)。
2、从采集的16份仔猪粪便样本中共分离到33株大肠杆菌和3株肺炎克雷伯菌。其中肺炎克雷伯菌均为多重耐药菌，对复方新诺明、四环素、氟苯尼考、环丙沙星、恩诺沙星、庆大霉素、阿米卡星、头孢他啶、头孢噻肟和氨曲南等10种药物均有耐药性。大肠杆菌的多重耐药率为93.94%(31/33)，对复方新诺明、四环素和氟苯尼考的耐药率高于90%；对庆大霉素、环丙沙星、恩诺沙星和头孢噻肟的耐药率较高，分别为84.85%、69.70%、69.70%和45.45%；对氨曲南和阿米卡星的耐药率分别为15.15%和18.18%。所有分离菌株均对美罗培南、亚胺培南、头孢西丁、替加环素和多粘菌素敏感。
3、多重耐药肺炎克雷伯菌KP4的全基因组测序结果表明该菌株包含2个质粒基因组，通过数据库共注释到83个耐药基因和56个毒力基因，并发现该菌株可产CTX-M-27型超广谱-β内酰胺酶(ESBLs)，且耐药基因tet(A)、tet(R)、floR、dfrV、sul1、qacE、aadA16、aac(6)-Ib-cr、qnrB2、arr-6和blaCTX-M-27位于同一质粒上。KP4致病因子与I型菌毛、ECP黏附素、铁载体、血红素载体、生物被膜、外膜蛋白等有关，但rmpA、magA、wabG等与荚膜合成相关的基因缺失。
本研究分析了某生猪养殖场腹泻和健康哺乳仔猪粪便菌群的多样性和结构差异，并获得了与仔猪腹泻相关致病菌的耐药特征以及猪源多重耐药肺炎克雷伯菌的耐药机理、致病机制和遗传背景，为有效预防、治疗仔猪腹泻和兽医临床合理使用抗生素提供依据，同时为开发有效防治肺炎克雷伯菌感染的新方法奠定基础。