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第一部分胶质瘤相关间充质干细胞与骨髓间充质干细胞的鉴定及差异背景:骨髓间充质干细胞(bm-MSCs)能与胶质瘤细胞相互作用,促进肿瘤血管生成。胶质瘤组织中也能分离出间充质干细胞。然而,胶质瘤相关间充质干细胞(gb-MSCs)的特点、功能以及与胶质瘤细胞的相互作用仍有待阐明。这一部分通过分离培养胶质瘤相关间充质干细胞与骨髓来源间充质干细胞,对两种细胞进行鉴定,同时,探讨两者形态、表型以及分化潜能的异同。方法:收集人脑胶质瘤(WHO III-IV级)标本并分离胶质瘤相关间充质干细胞;收集骨折病人骨髓标本并分离骨髓间充质干细胞,接种于10%胎牛血清的达尔伯克氏改良伊格尔氏培养液(10%DMEM)培养基中,并培养于37℃、CO2含量5%的温箱中。观察胶质瘤相关间充质干细胞和骨髓间充质干细胞的形态及生长情况。CCK-8实验检测胶质瘤相关间充质干细胞和骨髓间充质干细胞的增殖情况;流式细胞学检测胶质瘤相关间充质干细胞和骨髓间充质干细胞CD105、CD44、CD73、CD90、CD34、CD14、CD31及PDGFR-β的表达;脂肪细胞诱导培养基、成骨细胞诱导培养基及软骨细胞诱导培养基分别处理胶质瘤相关间充质干细胞和骨髓间充质干细胞,油红O染色观察两种细胞向脂肪细胞分化情况,西素红染色观察两种细胞向成骨细胞分化情况,阿尔新蓝染色观察两种细胞向软骨细胞分化情况。结果:胶质瘤相关间充质干细胞和骨髓间充质干细胞均呈梭型,且贴壁生长。与骨髓间充质干细胞相比,胶质瘤相关间充质干细胞增殖能力明显较强。胶质瘤相关间充质干细胞和骨髓间充质干细胞均阳性表达CD105、CD44、CD90及CD73,阴性表达CD34、CD14及CD31;与骨髓间充质干细胞相比,胶质瘤相关间充质干细胞CD90、CD73阳性细胞数明显较低,且阴性表达PDGFR-β。胶质瘤相关间充质干细胞和骨髓间充质干细胞均能向脂肪细胞,成骨细胞及软骨组织细胞分化。结论:胶质瘤组织中存在相关间充质干细胞,且其表面标记物CD90、CD73及PDGFR-β表达与骨髓干细胞存在明显差异。提示胶质瘤中相关间充质干细胞并非完全来源于骨髓间充质干细胞向胶质瘤的迁徙,可能在胶质瘤生长和发展过程中起到更为重要的作用。第二部分胶质瘤细胞条件培养液对胶质瘤相关间充质干细胞向血管周细胞分化及血管生成能力的影响目的:通过建立肿瘤相关间充质干细胞向血管周细胞分化模型,探究胶质瘤细胞条件培养液对胶质瘤相关间充质干细胞增殖、迁移,向血管周细胞分化及血管生成的影响。方法:培养原代胶质瘤相关间充质干细胞和血管内皮细胞系;收集不含血清的达尔伯克氏改良伊格尔氏培养液(0%DMEM)、含10%胎牛血清的达尔伯克氏改良伊格尔氏培养液(10%DMEM)、不含血清的胶质瘤细胞条件培养液(0%gb-CM)、标准胶质瘤细胞条件培养液(S-gb-CM)并分别与胶质瘤相关间充质干细胞共培养,用CCK-8实验检测胶质瘤相关间充质干细胞在不同条件培养基中的增殖能力;划痕实验检测胶质瘤相关间充质干细胞在不同条件培养基中的迁移能力;细胞免疫荧光检测0%DMEM和0%gb-CM中细胞α-SMA、Desmin、Nestin、NG2、CD105、VE-cadherin、CD31、SMM的表达;westen-blot检测不同条件培养液中细胞α-SMA和Desmin蛋白的表达水平。Di O荧光探针标记胶质瘤相关间充质干细胞,用血管生成实验观察不同条件培养液中胶质瘤相关间充质干细胞和血管内皮细胞血管生成的情况,并检测胶质瘤相关间充质干细胞在不同条件培养液中的血管形成能力。结果:与0%DMEM和10%DMEM相比,S-gb-CM和0%gb-CM对细胞增殖和迁移的刺激作用明显增强。胶质瘤细胞条件培养液能诱导胶质瘤相关间充质干细胞向血管周细胞分化。与普通培养基相比(0%DMEM和10%DMEM)胶质瘤细胞条件培养液(0%gb-CM和S-gb-CM)对胶质瘤相关间充质干细胞血管生成的刺激作用明显增强,且能促进血管结构的维持及胶质瘤相关间充质干细胞向血管内皮细胞黏附。结论:上述结果表明,胶质瘤细胞条件培养液能诱导胶质瘤相关间充质干细胞向血管周细胞分化,且对对其增殖、迁移、血管形成起到明显促进作用。第三部分胶质瘤相关间充质干细胞向血管周细胞分化的部分机制目的:探究胶质瘤细胞条件培养液中的促血管生成因子在胶质瘤相关间充质干细胞向血管周细胞分化中的作用以及胶质瘤细胞条件培养液对肿瘤相关间充质干细胞miRNA表达的影响。方法:收集不含血清的达尔伯克氏改良伊格尔氏培养液(0%DMEM)、含10%胎牛血清的达尔伯克氏改良伊格尔氏培养液(10%DMEM)、不含血清的胶质瘤细胞条件培养液(0%gb-CM)、标准胶质瘤细胞条件培养液(S-gb-CM),用ELISA试剂盒分别检测不同条件培养液上清中细胞因子VEGF、PDGF-β、FGF2、TGF-β的含量。将胶质瘤相关间充质干细胞分别与含重组VEGF或不含重组VEGF的0%DMEM培养液共培养,细胞免疫荧光检测不同培养基中细胞α-SMA的表达。将胶质瘤相关间充质干细胞分别与含抗VEGF抗体或不含抗VEGF抗体的0%gb-CM培养液共培养,westen-blot检测不同培养液中细胞α-SMA蛋白的表达水平。血管生成实验检测细胞在含抗VEGF抗体或不含抗VEGF抗体的0%gb-CM培养液中细胞的血管形成能力。用基因芯片技术检测不含血清的达尔伯克氏改良伊格尔氏培养液(0%DMEM)与不含血清的胶质瘤细胞条件培养液(0%gb-CM)中细胞miRNA的表达差异,并进行靶基因预测和通路分析。结果:胶质瘤细胞条件培养液中VEGF、PDGF-β、FGF2、TGF-β的含量与非胶质瘤细胞条件培养液中上述因子含量存在明显差异,且VEGF的差异最为明显。我们还发现VEGF能诱导胶质瘤相关间充质干细胞向血管周细胞分化。此外,基因芯片结果显示0%gb-CM中的细胞miRNA表达谱与0%DMEM中细胞相比存在明显差异,其中37个miRNA存在差异表达,且其目的基因所在的通路部分与新生血管形成有关。结论:上述实验表明,胶质瘤细胞能分泌多种促血管生成因子,细胞因子VEGF在胶质瘤相关间充质干细胞向血管周细胞分化的过程中起到极其重要的作用。同时,胶质瘤细胞条件培养液能诱导胶质瘤相关间充质干细胞miRNA表达的改变。