论文部分内容阅读
目的:旨在构建新西兰白兔宫腔粘连(intrauterine adhesions,IUA)模型,宫腔内移植兔脂肪间充质干细胞(rabbit adipose tissue-derived mesenchymal stem cells,rADSCs)、普兰尼克F127(Pluronic F-127,PF-127)水凝胶及两者复合物,研究比较其对子宫内膜的修复效应,探索促进受损子宫内膜再生、改善妊娠结局的可行治疗策略。方法:一、rADSCs-PF-127水凝胶复合物的制备及体外研究(一)rADSCs的分离、培养及鉴定1.无菌收集新西兰白兔腹股沟处脂肪,胶原酶消化法分离提取rADSCs,贴壁培养,传代纯化;2.流式细胞术分析检测rADSCs免疫表型:CD90、CD34及CD11b;3.rADSCs成脂、成骨诱导培养,鉴定其多向分化能力;4.CCK-8法检测rADSCs体外增殖能力。(二)PF-127水凝胶的制备及其温敏特性研究制备梯度浓度PF-127水凝胶溶液,恒温水浴测定其37℃下成胶所需时间,成胶后置于4℃鉴定其热可逆性。(三)rADSCs-PF-127水凝胶复合物的制备CCK-8法检测PF-127水凝胶与rADSCs的生物相容性,选择细胞亲和性最佳的PF-127水凝胶浓度包封细胞制备rADSCs-PF-127水凝胶复合物。二、新西兰白兔IUA模型的构建及造模效果的评估(一)新西兰白兔IUA模型的建立1.成年雌性新西兰白兔随机分为单纯机械损伤组及机械感染双损伤组,每组9只;2.两组分别通过机械刮宫及机械刮宫联合异物感染损伤新西兰白兔一侧子宫内膜模拟IUA形成,另一侧子宫作为假手术组进行自身对照不做任何处理;3.于造模术后7天、14天、28天分批处死新西兰白兔,收集双角子宫。(二)新西兰白兔IUA模型造模效果的评估通过HE染色及Masson染色观察比较子宫内膜形态、腺体数目及纤维化面积比例,选择造模稳定性更佳的造模方式。三、rADSCs-PF-127水凝胶复合物移植修复IUA兔子宫内膜(一)应用机械感染双损伤法构建新西兰白兔IUA模型,随机分为以下五组:1.假手术组(sham)、2.IUA模型组(IUA Model)、3.细胞组(rADSCs)、4.水凝胶组(PF-127)、5.复合物组(rADSCs+PF-127),造模术后 7 天分别将 rADSCs、PF-127水凝胶及rADSCs-PF-127水凝胶复合物注入宫腔,移植治疗后14天,处死新西兰白兔,收集子宫;(二)通过HE染色染色观察子宫内膜形态、计数腺体数目;(三)提取子宫组织总RNA,Real-time RT-PCR分析检测促纤维化信号通路相关因子(TGF-β 1、Smad3)、致炎细胞因子(IL-1 β)及子宫内膜容受性相关因子(整合素αvβ3、HOXA10)在基因水平的表达。成果:一、通过胶原酶消化法成功分离提取rADSCs,传代纯化后细胞呈梭形。流式细胞仪分析结果表明,rADSCs阳性表达CD90(99.7%),阴性表达CD34(1.72%)及CD11b(1.14%)。通过添加诱导分化培养基,rADSCs可以于体外定向诱导分化为脂肪细胞及骨细胞,具有多项分化潜能。第三代rADSCs体外增殖曲线呈“S”型,第1天增长速度较为缓慢,为潜伏期,第2-4天增长速度大幅提升,进入对数生长期,体外培养至第6-7天,生长速度再次趋于平缓,进入平台期,细胞数量变化不大。二、通过简单的机械刮宫,损伤后7天,新西兰白兔子宫内膜上皮基本实现完全再生,损伤后28天,新西兰白兔子宫内膜能够基本实现组织重建。而通过机械感染双损伤法建立的新西兰白兔IUA模型,于建模后28天病理学结果显示子宫内膜上皮未能实现完全再生,较单纯机械损伤法构建的IUA动物模型而言,是一种更为一种稳定的理想模型。三、HE染色观察结果显示,与假手术组相比,IUA模型组宫腔出现粘连甚至闭锁,光滑完整的腔体受到破坏,腺体数目显著减少(P=0.000<0.05)。然而,与IUA模型组子宫相比,在治疗组:细胞组、水凝胶组和复合物组中,受损的子宫腔形态均得到改善,腺体数目均显著上升(P<0.05)。复合物组新西兰白兔的腺体数目相较于细胞组(P=0.027<0.05)和支架组(P=0.019<0.05)而言,数目更多。Real-time RT-PCR 检测结果表明,与假手术组相比,IUA模型组中TGF-β1、Smad3和IL-1β mRNA的表达水平均显著增加(P<0.05),而整合素αvβ 3及HOXA10 mRNA的表达水平均显著下降(P<0.05);与IUA模型组相比,各治疗组(细胞组、水凝胶组和复合物组)中TGF-β1、Smad3和IL-1β mRNA的表达水平均显著下调(P<0.05),且整合素αvβ3及HOXA10 mRNA的表达水平均显著提高(P<0.05)。结论:宫内注射rADSCs、PF-127水凝胶及两者复合物,均能促进受损子宫内膜的结构重建及功能恢复,且联合应用的疗效最佳。