舌状蜈蚣藻抗氧化肽的制备、纯化及结构鉴定

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近年来,随着养殖技术不断进步和养殖规模逐渐扩大,蜈蚣藻的加工利用也逐渐引起人们的关注。目前关于蜈蚣藻源活性物质的研究集中于萜类、多糖类物质的提取和活性研究,而对于蜈蚣藻蛋白质和多肽的研究少之甚少。因此,为促进蜈蚣藻的开发利用,本文以舌状蜈蚣藻(Grateloupia livida)为原料,研究了蛋白质的提取工艺,并测定了其性质;研究了蛋白质酶解产物的抗氧化活性,并探究了脱色对酶解产物抗氧化活性的影响;对舌状蜈蚣藻抗氧化肽进行了纯化和鉴定,并通过数据库和在线工具对其进行生物信息学分析。主要研究内容及结果如下:第一部分:舌状蜈蚣藻蛋白质的提取及其性质研究以舌状蜈蚣藻为原料,以蛋白质提取率为指标,探究不同破壁技术对舌状蜈蚣藻蛋白质的提取效果,发现溶胀法、反复冻融法、珠磨法的最高蛋白质提取率分别为(29.66±0.86)%、(24.52±0.04)%、(26.52±0.79)%,均低于超声波辅助水提法。经过单因素试验和正交实验,确定超声波辅助水提法提取舌状蜈蚣藻蛋白质的最佳工艺条件为:液料比160 m L·g-1,超声全程时间60 min,超声功率1440 W,p H6.0,此条件下蛋白质提取率可达到58.16%。利用盐析法沉淀蛋白质,发现硫酸铵盐析法沉淀舌状蜈蚣藻蛋白质的最佳饱和度为65%,此时蛋白质回收率最大,为(84.19±0.71)%。对舌状蜈蚣藻蛋白质进行了SDS-PAGE分析,发现舌状蜈蚣藻蛋白质主要分子量范围在16~66 k Da。抗氧化活性分析结果表明,舌状蜈蚣藻蛋白质在1~8 mg·m L-1浓度范围内均具有较强抗氧化活性,其质量浓度为8 mg·m L-1时的还原力为(0.43±0.01),对DPPH自由基的半数清除浓度(IC50)为(4.00±0.97)mg·m L-1,对ABTS自由基的半数清除浓度(IC50)为(3.96±0.99)mg·m L-1。第二部分:蛋白质酶解产物的制备及其抗氧化活性研究以舌状蜈蚣藻蛋白质为原料,利用碱性蛋白酶、Protamex1.5L和中性蛋白酶进行水解,比较各种酶酶解产物的水解度和抗氧化活性,发现中性蛋白酶水解舌状蜈蚣藻蛋白质1 h的酶解产物抗氧化活性最高,其对DPPH自由基清除率的IC50为(3.96±0.41)mg·m L-1,对ABTS自由基清除率的IC50为(0.88±0.13)mg·m L-1,且当其质量浓度为8 mg·m L-1时,其还原力为(0.487±0.007)。为探究色基对蜈蚣藻酶解产物抗氧化活性的影响,对舌状蜈蚣藻蛋白质酶解产物进行脱色处理,发现活性炭脱色后,酶解产物抗氧化活性下降。中性蛋白酶酶解1 h的产物的DPPH自由基清除率和ABTS自由基清除率分别下降了5.62%、7.86%。第三部分:酶解产物的分离纯化及结构解析通过反向高效液相色谱(Reverse-phase High Performance Liquid Chromatogr-aphy,RP-HPLC)技术对舌状蜈蚣藻抗氧化肽进行纯化,共分离获得三个组分。比较各组分的抗氧化活性,发现组分F3抗氧化活性最高,其对DPPH自由基的清除率IC50为(2.43±0.59)mg·m L-1,质量浓度4 mg·m L-1时还原力为(0.263±0.005)。采用液相色谱串联质谱(Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry,LC-MS/MS)技术对高活性组分F3进行分析鉴定,共获得10种多肽。通过生物信息学预测分析10种多肽的理化性质、毒性、致敏性、ADMET性质等,筛选出其中一种多肽(LYEEMKESKVINADK)可能是良好的新型抗氧化活性肽。
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