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背景与目的多发性硬化(multiple sclerosis, MS)是一种中枢神经系统(central nervous system)的自身免疫性疾病,其典型病理改变为白质脱髓鞘、炎症细胞浸润、轴突损伤及血脑屏障的破坏等,有新旧病灶共存的特点。多发性硬化的病理形成机制尚不完全明确,近年通过尸检和一系列影像学等检查发现广泛的少突胶质细胞凋亡是最早出现的病理改变,并随即出现小胶质细胞激活、聚集,而此时髓鞘形态完整,无明显炎细胞浸润及轴突损伤等。之后数周甚至数月才出现单核巨噬细胞及淋巴细胞的浸润、白质脱髓鞘及轴突损伤等MS典型的病理改变,学者们用激活前损伤区(preactive lesion)的新概念来代表MS这种新发病灶出现时的早期病理改变,少突胶质细胞凋亡和小胶质细胞激活聚集是激活前损伤区特征性的改变。实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)C57BL/6小鼠模型是研究MS的理想动物模型,病程中呈典型的缓解-复发过程。本课题组早期研究发现,在EAE小鼠中,线粒体能量衰竭和损伤是引起少突胶质细胞凋亡的始动因素,可能是激活前损伤区形成的重要原因,从而导致MS典型病理改变的发生。并且我们发现线粒体损伤和神经细胞凋亡伴随整个EAE病理过程,与疾病严重程度一致。但造成线粒体损伤的原因尚不清楚。自噬是细胞维持稳态的重要生物现象,当线粒体受损时,细胞可启动自噬来清除受损的线粒体及凋亡因子,从而保护细胞免于坏死、凋亡的危险。此外,一系列研究证实自噬对T细胞具有前存活和前死亡的双重作用,是自身免疫及炎症反应的重要介导者。在离体培养的单核细胞中,也发现抑制自噬能促进IL-1β的分泌。说明白噬对炎症反应的发生也起着至关重要的作用。本实验探索自噬在EAE病程中的时序变化,并探讨自噬激活剂雷帕霉素(Rapamycin, RAP)对EAE线粒体凋亡的影响,以及予以自噬抑制剂3甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)后EAE小鼠炎症反应程度的变化,初步阐明自噬对EAE小鼠线粒体凋亡及炎症反应的作用,旨在为多发性硬化的治疗提供新的思路。方法第一部分：将96只C57BL/6雌性小鼠分为正常组、EAE模型组、EAE+雷帕霉素组、EAE+PBS组,EAE+雷帕霉素组自免疫日起每日腹腔注射雷帕霉素(lmg/kg/d)。神经功能评分观察各组小鼠神经功能变化。于免疫后3d、7d、16d、30d通过Western Blot检测各组小鼠脑白质Beclin-1及Cytochrome(cyt-c)表达水平,免疫荧光双标检测免疫后7天caspase-3在少突胶质细胞中表达水平。第二部分：20只C57BL/6雌性小鼠建模后分别于3、7、16、30 d用Western blot检测CNS中LC3B的变化。另将60只小鼠分为正常对照组、EAE模型组、EAE+3-MA组,EAE+3-MA组白免疫日起每日腹腔注射3-MA(100 nmol/pL,2 pL/d)神经功能评分观察备组小鼠神经功能变化。免疫组化检测各组小鼠免疫后7 d小胶质细胞激活情况,Western blot检测免疫后急性期(16d)慢性期(30 d)白介素-1β(IL-1β)的表达,HE染色观察CNS炎性细胞浸润情况。结果1. Western bolt示与正常组相比,EAE组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ自免疫后7d开始降低(P<0.05)此后一直呈低表达水平(P<0.01)beclinl表达水平与LC3B一致；cyt-c的表达自7d时显著升高(P<0.01),于16d时达高峰(P<0.01)自噬激活剂RAP能升高自噬相关蛋白beclinl的水平,抑制cyt-c表达水平(P<0.05)免疫荧光双标示EAE免疫后7d少突胶质细胞即高表达caspase-3,EAE+RAP组少突胶质细胞caspase-3表达水平低于模型组(P<0.05)2.免疫组织化学示EAE免疫后7 d即有小胶质细胞激活,EAE+3-MA组EAE小鼠小胶质细胞激活程度较EAE模型组严重P<0.05)Western bolt示免疫后16、30 d,EAE模型组高表达IL-1β,EAE+3-MA组小鼠IL-1β表达水平较同时间点EAE模型组商P<0.05)HE染色结果显示,EAE+3-MA组炎细胞浸润比同时间点EAE模型组加重(P<0.05)呈典型“血管袖套样”改变；3.EAE小鼠在最早免疫后9 d开始发病,大多数集中在12’16 d发病,并于16’20 d达到疾病高峰；EAE+RAP组EAE小鼠较模型组神经功能评分显著降低,疾病严重程度减轻(P<0.01)EAE+3-MA组小鼠发病时间提前,神经功能评分增高,疾病严重程度加重(P<0.05)结论1.在EAE免疫后7天就出现了自噬水平的降低,提示自噬水平的降低可能是EAE病理改变发生、发展的重要原因。2.自噬激活剂雷帕霉素能增加EAE自噬水平,降低免疫后早期少突胶质细胞凋亡,减少病程中线粒体凋亡关键蛋白cyt-c释放,可能是雷帕霉素通过增强自噬水平清除受损线粒体从而抑制线粒体损伤介导的细胞凋亡。3.自噬抑制剂3-MA能促进EAE免疫后早期小胶质激活、聚集,增加EAE急性期、慢性期IL-1β表达及炎细胞浸润,从而促进炎症的发生。4.自噬在EAE中有着抑制激活前损伤区形成、线粒体凋亡及抗炎的作用,对MS寻求治疗及预防复发提供了新的临床思路。