紫杉醇是美国北卡罗莱纳州三角研究所的Wall博士和Wani博士于1967年发现的。之后,他们又从太平洋红豆杉中分离出了这种化合物并发现它具有广泛的抗恶性肿瘤作用。紫杉醇是至今所知的最好的治疗卵巢癌和乳腺癌的药物,价格非常昂贵,市场售价为4800美元/克。并且它的自然资源—红豆杉和东非罗汉松(1999年测知含紫杉醇)均生长十分缓慢,数量有限且其中有效成分的含量非常低。东北红豆杉(Taxus cuspidata)是常绿乔木,散生于海拔500至1000米的密林中,适合冷且潮湿的酸性土壤,分布于朝鲜、俄罗斯远东地区、日本和我国的黑龙江东南部、吉林东部及辽宁。目的:随着近年来对紫杉醇及其前体物的需求量不断攀升,寻找新的生物资源保护生态环境已迫在眉睫。研究者们近年来通过提取分离得到了大量的紫杉醇类似物,但迄今为止仍没有紫杉醇的第二代药物上市。目前紫杉烷类成分只有紫杉醇和以巴卡亭Ⅲ或10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ为前体的半合成药物紫杉特尔(Taxotere)应用于临床。因此对新紫杉烷类药物的研究主要是寻找具有较低毒副作用、较高抗肿瘤选择性及对多种肿瘤细胞尤其是对有抗药性的人体肿瘤细胞有较高生物活性的紫杉烷类化合物。本研究的目的就是将从东北红豆杉中分离及纯化得到的紫杉烷类化合物进行抗肿瘤细胞增殖活性的筛选,为开发新的抗肿瘤药物提供理论依据。方法:1应用MTT比色法对所选取的东北红豆杉中的紫衫烷类化合物进行抗肿瘤细胞增殖的活性筛选。首先考察具有不同母核结构的紫衫烷类化合物对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响;然后考察具有相同母核结构、不同连接侧链的紫衫烷类化合物对HeLa细胞增殖的影响;最后选择母核结构和侧链都相同的紫衫烷类化合物,考察母核上的不同取代基对紫衫烷类化合物抗HeLa细胞增殖的影响。2选择具有活性母核结构、活性侧链和取代基的紫杉烷类化合物,考察它们对五种肿瘤细胞增殖的抑制作用。3机制研究:采用细胞增殖抑制试验,以Taxol作为阳性对照,观察HeLa细胞在经筛选出的活性化合物Compound 22作用48、96和144h后,分别计数细胞浓度,绘制细胞增殖曲线以进行比较。流式细胞仪及AnnexinⅤ-FITC试剂盒分析细胞凋亡情况。WesternBlot方法检测经化合物2α,10β-Diacetyl-5-cinnamoyl-phototaxicin II处理的HeLa细胞中Bax、Bcl-2、Caspase 3和Caspase 9的表达。结果:1 6/10/6母核结构的化合物7-Deacetyl-taxine E (17)即使用100μmol/L的浓度处理HeLa细胞,其生存率为97%,对HeLa细胞的增殖不显示任何抑制活性;6/8/6母核结构的化合物Decinnamoytaxinine E (12)、6/5/5/6母核结构的化合物Taxinine L (23)和6/12母核结构的化合物Taxachitriene A (24)三种化合物用100μmol/L的浓度处理HeLa细胞,对其增殖显示较弱的抑制活性,生存率分别为74%、73%和71%,与空白对照相比均有显著性差异(P<0.05)。22.1 6/8/6母核结构的5位碳原子上连接具有水溶性的糖侧链的紫杉烷类化合物(10),用1μmol/L、10μmol/L和100μmol/L处理HeLa细胞,其生存率分别为98%、86%和79%;在6/8/6母核结构的5位碳原子上连接具有脂溶性的Cinnamoyl侧链的紫杉烷类化合物(9)和连接具有碱性的Winterstein侧链的紫杉烷类化合物(2),用1μmol/L、10μmol/L和100μmol/L处理HeLa细胞,其生存率分别为84%、46%、21%和89%、86%、34%,对HeLa细胞增殖显示较强的抑制活性,均呈现较好的剂量依赖关系。2.2只具有6/12母核结构,没有连接任何侧链的化合物(24)用1μmol/L、10μmol/L和100μmol/L处理HeLa细胞,其生存率分别为100%、97%和71%,对HeLa细胞的增殖显示较弱的抑制活性,当在5位碳原子上引入脂溶性的Cinnamoyl侧链的化合物(25),用与化合物(24)相同的浓度处理HeLa细胞,其生存率分别为100%、100%和65%,未显示一个明显的抗肿瘤细胞增殖活性的提高。2.3只具有6/5/5/6母核结构,没有连接任何侧链的化合物(23)用1μmol/L、10μmol/L和100μmol/L处理HeLa细胞,其生存率分别为100%、93%和73%,对HeLa细胞的增殖显示较弱的抑制活性,当在5位碳原子上引入脂溶性的Cinnamoyl侧链的化合物(22),用与化合物23相同的浓度处理HeLa细胞,其生存率分别为100%、64%和32%,10μmol/L和100μmol/L组与空白对照组相比具有显著性(P<0.05)和非常显著性的差异(P<0.01),明显地提高了这类紫杉烷化合物的抗肿瘤细胞增殖活性。2.4只具有6/10/6母核结构,没有连接任何侧链的化合物(17)用1μmol/L、10μmol/L和100μmol/L处理HeLa细胞,其生存率分别为100%、100%和97%,对HeLa细胞的增殖不显示任何抑制活性;当在5位碳原子上引入脂溶性的Cinnamoyl侧链的化合物(18)和具有碱性的Winterstein侧链的化合物(19),用与化合物(17)相同的浓度处理HeLa细胞,其生存率分别为100%、100%、95%和98%、97%、73%,均未显示一个明显的抗肿瘤细胞增殖活性的提高。3当母核上的取代基均为乙酰基的化合物(6),用100μmol/L处理HeLa细胞,其生存率下降为66%;当母核上有一个羟基取代基的紫杉烷类化合物(8)用100μmol/L处理HeLa细胞,其生存率下降为51%;当母核上有两个羟基取代基的紫杉烷类化合物(9)用相同浓度处理HeLa细胞,其生存率继续下降为21%。4化合物(7)对HEC-1细胞、T-98细胞和HMV-1细胞的增殖具有抑制活性,IC50分别为32μmol/L、37μmol/L和23μmol/L,化合物(9)仅对HEC-1细胞的增殖具有抑制活性,IC50为33μmol/L,化合物(22)对HEC-1细胞、HOC-21细胞、T-98细胞和HMV-1细胞的增殖均具有抑制活性,IC50分别为58μmol/L、15μmol/L、11μmol/L和36μmol/L。5 HeLa细胞增殖实验的结果表明:紫杉烷类化合物2α,10β-Diacetyl-5-cinnamoyl-phototaxicin II (22)干扰肿瘤细胞增殖的作用趋势与紫杉醇极其相似(图20),因此推测其发挥抗肿瘤细胞增殖作用可能与干扰细胞周期有关。6经凋亡实验研究证实,化合物(22)可以抑制肿瘤细胞的增殖。它通过引起肿瘤细胞的凋亡从而减少肿瘤细胞的数量,通过激活caspase通路引起Hela细胞的凋亡(图23),而且Bcl-2家族蛋白也参与了此凋亡反应,增加了促凋亡蛋白Bax的表达,以及抑制抑凋亡蛋白Bcl-2,从而实现其诱导HeLa细胞的凋亡(图22)。结论:1.具有6/8/6三环和6/5/5/6四环母核结构的紫杉烷类化合物具有抗肿瘤细胞增殖活性。2. Cinnamoyl侧链和Winterstein酰基侧链的存在,均能增加6/8/6三环和6/5/5/6四环母核结构的紫杉烷类化合物抗肿瘤细胞增殖活性。3.母核上的取代基为羟基的化合物的活性要高于取代基为乙酰基的化合物,且其活性与羟基的数量成正比。4.紫杉烷类化合物(22)通过激活caspase通路引起Hela细胞的凋亡。而且通过增加促凋亡蛋白Bax的表达,以及抑制抑凋亡蛋白Bcl-2,实现其诱导HeLa细胞的凋亡。