论文部分内容阅读
目的：先天性小眼球和无眼球是一类以眼球前后径小于正常范围或眶内眼组织完全缺如为特征的先天性眼发育异常性疾病,遗传方式包括常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传和X连锁隐性遗传等。在我国,小眼球的发病率为11.8/10万,其中75%-90%为散发病例。先天性眼盲病例中16.6%患有小眼球或无眼球,是我国儿童失明的主要原因之一。近年来,人类配对盒PAX6、SRY相关高迁移率集团2SOX2和正小齿同源物2OTX2等转录因子的编码基因被确定为先天性小眼球和无眼球的主要致病基因。
人类OTX2基因定位于染色体14q22.23区,共包含3个外显子,编码由289个氨基酸构成的转录因子。OTX2包含N末端结构域(1～21aa),1个高度保守的同源结构域(38～100aa)和C末端转录激活域(153～235aa)。其中高度保守的同源结构域为DNA结合域,可形成螺旋一转角一螺旋结构,与DNA序列相结合。OTX2在发育的视泡中广泛表达,在指导视泡外翻与外胚层接触过程中起重要作用。动物实验证实Otx2在小鼠脑发育阶段表达于间脑、中脑以及端脑的腹背区域,并对视网膜色素上皮的分化起关键作用。
OTX2转录因子通过结合到DNA序列上,改变相关基因的表达,进而导致相应的临床表现。受OTX2调控的基因包括光间受体视黄类物质结合蛋白IRBP(IRBP),Ⅰ级POU结构域转录因子ⅠPOU1F1(POUdomain,classⅠ,transcription factorⅠ,POU1F1),ES细胞表达同源盒lHESXI(Homcobox,ES cell expressed1,HESX1),BEST1(bestrophin1),促性腺激素释放激素1GNRH1(gonadotropin-releasing hormonel,GNRH1)等,其中IRBP与眼发育相关,而POU1F1则与垂体功能相关。
本课题前期在一汉族家系中发现一个新的错义突变c.203G＞C,该突变位于DNA结合域的编码序列,导致蛋白质p.Arg68Pro改变。通过对不同物种OTX2蛋白序列的对比,发现此位点高度保守。为了明确该区域的功能,本研究拟定点突变保守区域的65位和7l位氨基酸,并选取文献报道的7种未进行功能鉴定的突变位点,构建突变型OTX2表达载体,将OTX2表达载体与.IRBP/POU1F1启动子区荧光素酶报告基因载体共转染HEK293细胞,检测下游基因IRBP和POU1F1启动子区载体的荧光素酶活性,以初步鉴定上述突变的功能。
材料与方法:
1.实验材料:人胚肾细胞系HEK293;细胞培养相关试剂;TA克隆载体pMD18-T;DUAL-GLOTM双荧光素酶检测系统等。
2.实验方法:突变型OTX2表达载体构建及测序;软件预测突变型OTX2蛋白三维构象;与pGL3-IRBP和pGL3-POtJ1F1载体共转染HEK293细胞;荧光素酶活性检测。
结果:
1.成功构建了9种OTX2突变的表达载体并进行了测序验证;
2.对突变型OTX2蛋白的三维结构进行了预测;
3.野生型OTX2可使IRBP转录活性提高约8.75倍,7种突变型OTX2则降低了IRBP的启动子转录活性(*P＜0.05)。与野生型OTX2相比,p.Ile65Asp和p.Va171Glu均使下游基因转录活性下降,但差异无统计学意义(P＞0.05)。
4.野生型OTX2可使POU1F1转录活性提高约7.5倍,7种突变型OTX2则降低了POU1F1启动子转录活性(*P＜0.05)。与野生型OTX2相比,p.Ile65Asp和p.Va17lGlu均使下游基因转录活性下降,但差异无统计学意义(P＞0.05)。
结论:
文献报道的7种OTX2突变显著降低了IRBP和POU1F1启动子的转录活性;65位及71位氨基酸定点突变对IRBP和POU1F1启动子转录活性无影响。