前言 三硝基甲苯(TNT)有6种同分异构体，一般指2，4，6-三硝基甲苯。TNT是合成炸药的主要原料，广泛应用于国防、采矿、开凿隧道和化学工业。TNT中毒是我国常见职业病之一，其毒性作用范围广，主要引起白内障，肝脏病变和血液损害。虽然TNT的毒性研究早在20世纪初期开始，但至今TNT毒理学机制尚不十分清楚。近年来，TNT的还原活化学说即自由基机制是研究较深入的毒性机制之一。TNT是一种可引起氧化应激的毒物，一般认为，TNT在体内主要通过硝基的还原进行代谢转化：TNT接受来自NADPH的一个电子，被还原活化为硝基阴离子自由基，在有氧条件下进一步形成超氧阴离子自由基、羟自由基和过氧化氢等。使体内还原物质如谷胱甘肽含量降低，脂质过氧化及钙稳态失衡，导致膜结构损伤，细胞代谢紊乱甚至死亡。 TNT进入体内经氧化还原形成十几种代谢产物，其中有4羟胺-2，6-二硝基甲苯(4HA)，4氨基-2，6-二硝基甲苯(4A)，2，4-二氨基-6-硝基甲苯，2，6-二氨基-4-硝基甲苯等。肝脏作为重要的解毒器官，在TNT代谢中，起着重要的作用。NADPH能诱发肝微粒体发生脂质过氧化，酶促微粒体脂质过氧化模型为理想的研究模型，是探索毒物的脂质过氧化机理及筛选确实有效的抗氧化剂的重要手段。目前对于TNT及其代谢物肝毒性的研究还很少，本实验建立肝微粒体反应体系，选取MDA为指标，探索TNT及其代谢物对大鼠肝微粒体脂质过氧化损伤的可能的毒性机制。 实验材料 1．实验动物 选取健康雌性Wistar大鼠（由中国医科大学实验动物部提供），体重 200－250克。 入实验器材与试剂 2．l 实验器材 722型分光光度计（上海第三分析仪器厂制造厂LT－92型水浴恒温振荡器（辽宁省辽阳白塔理化电器厂厂分析天平，586型计算机，SU陀R T－21高速离心机（SORVALL DUPOND USA）和高速冷冻离心 机RC 285（SORVALL DUPOND USA）等。 2．2 实验试剂 TNT由辽宁阜新煤矿TNT厂提供，经重结晶纯化后使用，纯度大于 99．9％。4HA／A（由日本提供厂还原型辅酶 11为 BIOM产品（华美分装厂所有分析试剂均为分析纯。 实验方法 1．大鼠肝微粒体的准备 大鼠禁食 12小时，断头处死，经门静脉用冰冷的二．15％KCI溶液将肝脏洗至淡黄色。以1：3比例制备肝匀浆，匀浆介质为含0．154mo＊L KCI的 50mmo＊L Tis－HCI（pH7．4）缓冲液。先以100009离心20分钟，上清液进一步在105000 g离心60分钟。弃上清，将沉淀悬浮于0．15moUL Tis－HCI含smmol／L MgCI。hH7．4）缓冲液中，使每克湿重鼠肝与豆Inl缓冲液混合后得到的微粒体组分悬浮液中每毫升约含有蛋白质10mg。上述操作均在4t完成。考马斯亮蓝G－250染色法测定微粒体蛋白浓度，牛血清白蛋白作为标准。 2．实验分组 ·2· 空白对照组、溶剂对照组、TNT组产HA组和4A组（TN／HA和 4A溶于丙酮人 TNT／ 和 4A的剂量均设为0．55 nmollL．2．19nmol／L、8．75runoVL、35runol／L和140xunoVL。 3．反应体系 TNT户HA和4A每一剂量组样本数为6，每一样本的总体积为IInl。其中0．15mol／LTris－HCI含smmol／LMgCI／PH7．4）缓冲液700 gi，缓冲液终浓度为0·lmol／L；蛋白浓度为10mg／Inl的微粒体悬浮液 100…，微粒体蛋白终浓度为 ling／all；snunoUL NAD－PH 100pl，NADPH终浓度为 0．snunol／L；丙酮或终浓度为0．55nxno＊L、2．19nmo＊L、8．75runol／L、35nmo＊L和 140nmo＊L的TNT、4HA和4A均100gi。 4．反应条件 37℃水浴恒温振荡器中孵育1小时。 5．TBA法测定MDA的含量。 6．数据处理 所有数据输人586计算机，用 SPSS 10．0 For Windows统计软件进行单因素方差分析对unmtt t检验。 实验结果 1．不同浓度三种受试物MDA含量的变化 37T水浴恒温振荡器中孵育1／J’时，TNT 140nmol／L和4HA。4A的 8．75nmoVL、35nmoVI。和140 删oVL剂量组抑制 MDA的生成，与空白对照组相比差异有显著性。TNT 0．55tunol／L剂量组MDA含量升高，与空白对照组相比差异有显著性。 2．最佳受试物作用浓度的选取 0．55nmol／L为最佳受试物作用浓度。 3．最佳受试物作用时间的选取 60min为最佳受试物作用时间。 4．加人抗氧化剂后MDA含量的变化 ·3· 37℃水浴恒温振荡器中孵育1小时，向含三种受试物的反应体系中分别加人终浓度 10mmoUL VitC或终浓度 InunoVL GSH100叫（每个样本的总体积仍为lrnlX抑制MDA的生成，与TNT。4HA和 4A（0．55nmoUU60min组 MDA含量相比差异有显著性。 讨 论 ’fNT中毒发病机制尚未完全阐明。国内外学者注意到自由基和脂质过氧化反应在TNT中毒发展中所起的作用。本实验中：37℃水浴恒温振荡器中孵育 1／J’时