论文部分内容阅读
背景：恶性肿瘤目前仍占人类各种死因的第一位或第二位，每年全世界约有700万人死于癌症，且发病和死亡例数呈明显上升趋势，原发性肝癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率均一直居于前五位，严重威胁人民群众的生命及健康[1]。肝癌是上皮恶性肿瘤的一种，淋巴道转移是其早期转移的主要方式，与肿瘤预后密切相关。，但其机制仍不清楚，成为治疗的难点，尽早发现并防止肝癌转移则成为提高患者术后生存率的关键。本课题组前期通过来源于同一亲本且遗传背景相似、但具有明显不同高低淋巴道转移能力的肝癌细胞株（Hca-F细胞和Hca-P细胞相比对），利用基因芯片技术、定量蛋白质组学技术-荧光差异双向凝胶电泳技术比对研究发现，活化的蛋白激酶C受体1(receptor of activated C-kinase1，Rack1)，又名Gnb2L1，是在mRNA水平和蛋白质水平都有显著差异性表达的基因。Rack1是一种胞内支架蛋白，1991年被首次发现，因可能参与调控肿瘤的多种生物学行为而备受关注。然而该基因与肝癌的生物学行为的相关性等问题，目前尚无明确的全面的的研究报道，更无促进肝癌细胞增值、迁移运动和侵袭转移的分子机制的研究报道。目的：1.构建PGPU6/GFP/Neo-shRNA-Rack1和PGPU6/GFP/Neo-shRNA-NC表达载体，稳定转染至Hca-F细胞，得到Rack1基因的FR a c k1下调细胞株2.研究Rack1基因表达下调后细胞在增值能力、迁移能力、侵袭能力等方面的变化，深入研究Rack1基因表达水平改变对细胞生物学行为产生的影响。方法：1．针对Rack1基因设计4个不同位点的shRNA，同时设计无关序列阴性对照，将其稳定转染至Hca-F细胞中，分别获得未处理组F细胞、4组不同靶点的FR a ck1下调细胞、FR a c k1无关序列细胞。2．应用Westernblot和Real time qRT-PCR分别在蛋白质水平和mRNA水平检测干扰Rack1基因的表达情况，将抑制效果最明显的一组序列扩增用于后续实验。3.用抑制效果最明显的FR ac k1下调细胞、FR a ck1无关序列细胞和F细胞三组细胞作相关功能试验。采用CCK8试剂盒测其在450nm波长处吸光值，可检测出活细胞的数量，反映各组细胞增殖能力的改变。应用Transwell小室细胞研究肿瘤细胞的迁移、侵袭能力，均选用8.0μm膜，通过饥饿培养以及上下室培养液的高低营养差，趋使细胞运动，计数细胞数检测各组细胞迁移、侵袭能力的改变。结果：1．经过测序鉴定，重组质粒与目的基因的序列相符，说明Rack1基因的质粒构建成功。2．应用Real time qRT-PCR在基因水平检测，与Hca-F细胞正常组相比，4组不同位点的FR a ck1下调细胞中292号靶点的FR a c k1下调1号组干扰效率最高为70%，1105号靶点的FR a ck1下调3号组干扰效率次之为52%。应用Western blot在蛋白水平检测，4组不同位点的FR a c k1下调细胞中292号靶点的FR ac k1下调1号组干扰效率最高为44%，1105号靶点的FR a c k1下调3号组干扰效率为34%。结合Real time qRT-PCR和Western blot的检测结果，4组不同位点的FR ac k1下调细胞中292号靶点的FR a ck1下调1号组抑制效果最明显，可作为后续功能实验的FR a ck1下调细胞株进行研究。3． CCK8检测细胞增殖能力实验结果显示FRack1下调组细胞增殖OD值明显下降，FR ac k1下调细胞与FR a ck1无关序列细胞、FR a ck1下调细胞与F细胞OD值差异均有统计学意义（P<0.05），FR a c k1无关序列细胞与F细胞OD值差异无统计学意义（P>0.05），提示Rack1基因表达下调后F细胞的增殖能力明显下降。迁移能力实验结果表明FR a c k1下调细胞迁移数明显下降，FR a ck1下调组细胞迁移数为14.27±1.79；FR a c k1无关序列组细胞迁移数为39.53±3.23；F组细胞迁移数为39.47±6.31，提示Rack1基因表达下调后F细胞的迁移能力下降，差异有统计学意义（P<0.05）。侵袭能力实验结果表明FR a ck1下调细胞侵袭数明显下降，FR ac k1下调组细胞侵袭数为8.13±1.55；FR a c k1无关序列组细胞侵袭数为21.23±3.80；F组细胞侵袭数为22.20±2.26，提示Rack1基因表达下调后F细胞的侵袭能力下降，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：1．成功地利用目的基因构建四个不同位点的FR a c k1下调以及用以阴性对照的FR a c k1无关序列表达载体，稳定转染至F细胞，获得4组Rack1稳定下调的FR a ck1下调细胞株。2．经Real time qRT-PCR和Western blot验证4组FR ac k1下调细胞中292号位点Rack1干扰效率最明显，为进行研究Rack1功能实验的FR a ck1下调组细胞株。3．CCK8实验和Transwell小室实验表明，Rack1基因下调后，具有高淋巴道转移潜能的Hca-F细胞增殖能力下降、迁移能力和侵袭能力下降。