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第一部分C3aR1基因慢病毒载体的构建目的：构建C3aR1（complement component3a receptor1）基因的慢病毒载体，为研究该基因在白血病细胞中的功能奠定基础。方法：1.利用基因克隆技术，扩增出人补体C3a受体1(C3aR1)基因，插入pMD19质粒中，进行测序分析。2.基因重组构建慢病毒载体质粒C3aR1-Venus，采用磷酸钙沉淀法转染人肾上皮细胞系293T，包装慢病毒颗粒。结果：所获C3aR1基因经测序与GenBank比对序列一致。慢病毒载体质粒C3aR1-Venus经BamHI酶切鉴定片段大小正确。转染72h后在荧光显微镜下观察，大于90%的293T细胞表达绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein，GFP）。结论：我们成功构建带有C3aR1基因的慢病毒载体，为研究C3aR1基因在白血病细胞中的功能奠定了基础。第二部分C3aR1基因在白血病细胞中稳定表达及其生物学功能研究目的：通过慢病毒载体介导C3aR1在白血病细胞株HL-60和K562中稳定高表达，观察C3aR1基因及C3a-C3aR轴对HL-60和K562细胞增殖、分化、凋亡、迁移及细胞周期的影响，初步探讨C3aR1基因在白血病细胞中的生物学功能。方法：1.向HL-60/K562细胞中加入富含慢病毒颗粒的上清液，共培养72h，流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）检测GFP表达情况，评估感染效率；反转录PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）、FCM检测C3aR1在细胞中的表达。2.将实验细胞分成三组：未转染组，空载体Venus转染组以及C3aR1转染组，使用CCK-8试剂盒测定细胞活力，绘制细胞生长曲线，对比细胞增殖情况，观察C3aR1对HL-60及K562细胞增殖的影响；3.全反式维甲酸（0.5μM）诱导HL-60细胞分化，硝基蓝四氮唑还原实验（NBT还原试验）观察C3aR1对细胞分化的影响；4.三氧化二砷（ATO，5μM）作用HL-60细胞24小时诱导凋亡，FCM检测HL-60各组细胞凋亡的差异；5.通过穿膜实验观察高表达C3aR1后HL-60细胞对趋化因子SDF-1（200ng/ml）的反应性；6.通过FCM分析C3aR1对HL-60细胞周期的影响；7.用C3a(1μg/ml)预处理细胞30min后，重复CCK-8法、NBT还原实验、FCM及穿膜试验来观察高表达C3a-C3aR1轴对细胞增殖、分化、凋亡、迁移及细胞周期的影响。结果：1.重组慢病毒C3aR1-Venus感染HL-60及K562细胞，GFP阳性细胞比分别为96.68%和93.94%。2. CCK-8法绘制生长曲线，C3aR1转染组与对照组(空载体载体转染组及未转染组，下同)的细胞增殖无明显差异（P＞0.05）；3.维甲酸诱导HL-60细胞分化，NBT还原实验显示C3aR1转染组与对照组细胞分化能力无明显差异（P=0.409）；4.ATO诱导HL-60细胞凋亡，FCM结果表明C3aR1的表达对细胞凋亡无显著影响（P=0.272）；5.通过穿膜实验我们发现，SDF-1单独存在时，HL-60-C3aR1转染组与对照组细胞的穿膜能力无明显差异（1.28±0.04vs1.13±0.28vs1.37±0.17，P=0.212）；C3a与SDF-1同时存在，HL-60-C3aR1转染组的穿膜能力较对照组明显升高(2.27±0.17vs1.45±0.07vs1.5±0.17，P=0.018)；6.我们采用FCM检测HL-60细胞周期发现，C3aR1的表达对细胞周期无显著影响（P=0.260）；7.细胞用C3a预处理之后，其增殖、分化、凋亡及细胞周期均无明显变化。结论：1.C3aR1的表达对HL-60及K562细胞的增殖无显著影响。2.高表达C3aR1不影响HL-60细胞的分化、凋亡和细胞周期。3. C3a-C3aR1轴对HL-60及K562细胞的增殖、分化、凋亡及细胞周期无明显影响。4.C3a-C3aR1轴可以增强HL-60对趋化因子SDF-1的反应性。第三部分探讨C3aR1基因对细胞耐药性的影响目的：研究C3aR1基因的表达对HL-60及K562耐药性影响，以及C3a-C3aR1轴在其中所起的作用。方法：1.用5种化疗药物(阿糖胞苷、柔红霉素、依托泊苷、ATO、ABT-737)作用HL-60及K562细胞24h，CCK-8法检测细胞抑制率，观察C3aR1基因对药物敏感性的影响；2.将HL-60及K562细胞用C3a(1μg/ml)预处理30min后，以不同浓度的依托泊苷(VP-16)及ABT-737作用细胞24h，CCK-8法检测细胞抑制率；取VP-16浓度为100ng/ml组的HL-60细胞行FCM，分析细胞周期变化。结果:1.加药实验显示5种化疗药物中，HL-60-C3aR1细胞对VP-16（100ng/ml，0.53±0.058vs0.49±0.022vs0.28±0.027，P=0.007）、ABT-737（100nM，0.27±0.082vs0.29±0.026vs0.12±0.021，P=0.011）两种化疗药物表现出明显的耐药性；而K562-C3aR1细胞仅对VP-16耐药性增强（8μg/ml，0.49±0.017vs0.34±0.023，P=0.011）。2.C3a预处理之后的细胞对VP-16、ABT-737的敏感性无明显变化。FCM结果显示VP-16主要作用于HL-60及K562细胞的G2期。HL-60细胞VP-16作用前vs VP-16作用后G2期分别为：7.0±2.13vs57.0±4.24（P=0.018），HL-60-C3aR1细胞被药物阻滞在G2期的比例明显低于对照组（57.0±4.24vs42.0±2.18，P=0.033)；C3a预处理前后C3aR1-Venus细胞G2期细胞的比例无显著变化（42.0±2.18vs46.5±4.49，P=0.246）。K562细胞VP-16作用前vs作用后G2期分别为：40.4±2.19vs61.9±2.41(P=0.011)，K562-C3aR1细胞被药物阻滞在G2期的比例明显低于对照组（61.9±2.41vs45.3±3.74，P=0.023)；C3a预处理前后K562-C3aR1细胞G2期细胞的比例无显著变化（35.3±5.23vs41.5±4.94，P=0.204）。结论：1.C3aR1的表达能够增强HL-60细胞对VP-16及ABT-737、K562细胞对VP16的耐药性，不影响HL-60细胞对柔红霉素、阿糖胞苷及ATO的药物敏感新；2.经C3a预处理之后的细胞对VP-16及ABT-737的药物敏感性并无显著变化；3.VP-16主要是通过将HL-60和K562细胞周期阻滞在G2期，C3aR1的表达能够减轻这种阻滞作用介导耐药，C3a-C3aR轴没有参与介导耐药这一过程。第四部分C3aR1基因在急性髓性白血病中的表达及其临床意义目的:探讨C3aR1基因在急性髓性白血病(acute myeloblastic leukemia, AML)患者原代骨髓细胞中的表达情况及其与AML各项临床特征的相关性及预后意义。方法:病例来源于2007-2011年期间在苏州大学附属第一医院诊断和治疗的急性髓细胞白血病患者319例(初诊=121例，缓解=163例，复发=35例，排除急性早幼粒细胞白血病)。采用患者的骨髓标本分离单个核细胞提取总RNA，逆转录成cDNA，利用实时荧光定量RT-PCR方法检测C3aR1基因的转录水平，结合临床资料，分析其在AML中的表达差异及生存时间进行相关性分析。结果:1.在AML患者中,在疾病的不同发展阶段C3aR1基因转录水平存在显著的差异。在初诊和复发AML标本中，C3aR1转录水平显著高于完全缓解组(CR)(P﹤0.05)，但初诊与复发之间无明显差异(Median=0.018373VS Median=0.013974，P=0.242)。2.28例60岁以下的AML-M2患者其高表达C3aR1总生存期(OS)缩短，是不良预后因素(P=0.043)。3.14例伴AML/ETO融合基因阳性的AML-M2患者，高转录水平的C3aR1生存期短(P=0.045)。结论:在急性髓细胞白血病中，C3aR1基因的转录水平与疾病的进程密切相关,C3aR1高表达是不良预后的因素，结合前期实验数据，C3aR1可能是通过促进白血病细胞的髓外迁移、影响白血病细胞对化疗药物的敏感性而发挥作用。