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防御性多肽是生物体分泌、有防御功能(如抵抗捕食者或寄生虫侵袭、微生物感染或保护自己不受到环境因子损伤等)的一类生物活性物质。抗菌肽是防御性多肽中的一个大类群,在生物体抗感染免疫中起关键作用,而防御素(Defensins)是目前已报道的研究最深入、种类最丰富的抗菌肽家族。迄今为止,已有300多个defensins家族成员报道于从原核生物到真核生物的广泛生物类群。但在抗菌肽来源最丰富的生物类群两栖类中,defensins却极少报道。本研究从广西棱皮树蛙(Theloderma kwangsiensis)皮肤分泌物中分离鉴定了一个新颖的defensins家族成员:Defensin-TK。筛选树蛙皮肤cDNA文库获得编码Defensin-TK克隆子,由cDNA序列推导的Defensin-TK前体包含3个部分:信号肽区、前体肽区和42个氨基酸残基成熟肽区。Defensin-TK与福鼎蝾螈(Cynops fudingens)is defensin CFBD-1同源性高,序列一致性47.46%。β-defensins形成3对链内二硫键的6个半胱氨酸残基位点在Defensin-TK成熟肽区也保守。脊椎动物defensins系统发生分析显示Defensin-TK与CFBD-1亲缘关系最近,且与鱼类β-defensins聚在一枝。推导的Defensin-TK理论等电点为4.83。综上所述,Defensin-TK是一个新颖的defensins家族阴离子抗菌肽。抑菌活性分析显示Defensin-TK对G+/G-菌和真菌都有很强的抑菌活性,最低抑菌活性分别为Escherichia coli ATCC25922 12 μg/mL、Bacillus dtyseneriae 3 μg/mL、Staphylococcus aureus ATCC25923 μg/mL和Candida albicans ATCC2002 6μg/mL。且Defensin-TK溶血活性低,50 μg/mL溶血率为1.5%。Defensin-TK的强广谱抗菌活性、低溶血活性提示Defensin-TK可能是一个良好的抗感染药物候选物。蝎毒是由多肽、蛋白质以及其它组分构成的高度复杂混合物。由于蝎毒多肽组分在蝎子捕食和防御行为中起关键作用,因此蝎毒多肽有多样性的生物学活性,并是天然药物分子的重要来源。马氏钳蝎(Mesobuthus martensii)是一味传统中药,但在300多个已鉴定的马氏钳蝎蝎毒蛋白质组分中,只有少数是多肽类蝎毒组分。本研究组合RNA-Seq高通量转录组分析和LC-MS/MS肽组分析探讨马氏钳蝎蝎毒组分多样性,共鉴定了 153个蝎毒蛋白质多肽组分,其中26个是已报道的马氏钳蝎蝎毒组分,127个为新鉴定的组分。在127个新鉴定的蝎毒组分中,97个是已知蝎毒组分的同源物,另30个是完全未知的新颖蝎毒组分。组合肽组和转录组分析,鉴定了一个BmKKx1同源毒素多肽BmKKx1-1,虽然二者氨基酸序列只有2个位点差异,但BmKKx1-1肽链长度和二硫键模式都与BmKKx1不同,是新颖的毒素多肽。比较毒素家族氨基酸序列的保守性和多态性显示,在马氏钳蝎钠离子通道毒素和钾离子通道毒素家族中存在不同的保守区和高变异多态性区域,提示在捕食和防御等选择压力下,蝎毒素存在高度多态性。综上所述,组合RNA-Seq和LC-MS/MS的蝎毒肽组分析策略是研究蝎毒多样性的有效手段,采用该策略本研究从马氏钳蝎蝎毒中鉴定了大量的新颖蝎毒多肽,拓展了我们对蝎毒多样性的认知,并为蝎毒来源药物开发提供了新组分。基于蝎毒组学研究提示,组合色谱技术,从马氏钳蝎蝎毒中分离鉴定了钠离子通道抑制剂BmKaTX15。BmKaTX15选择性抑制ITX-R型钠通道,IC50为5×10-3μM;稳态激活与稳态失活分析提示BmKaTX15可能作用于钠通道的孔区。上述结果提示在生物学上BmKaTX15能够快速麻痹猎物或天敌的神经系统,增加捕获猎物或躲避天敌的成功率;也提示BmKaTX15可作为开发钠离子通道药物的候选物。