论文部分内容阅读
微生物呼吸代谢是地球生物化学过程和生物工程系统的核心驱动力。大量研究发现微生物的代谢底物类型、途径和代谢活性随着电子受体的不同而改变。理论上,微生物呼吸代谢过程中利用某种电子供体所获得的能量与所利用的电子受体氧化还原电势（EARP）呈正相关,因此一般认为电子受体氧化还原电势是决定微生物代谢途径的关键因素。由于实际电子受体的溶解度、浓度、分子结构等特性可能会影响微生物的呼吸代谢过程,且传统的基因分析方法受通量和深度等的限制,因此EARP及电子受体的其他物理化学特性对微生物代谢的影响在微生物学研究中一直未得到准确客观的分析和评估。微生物电化学系统（Microbial electrochemical system,MES）电极的氧化还原电位能被精准设定且可作为部分微生物呼吸的电子受体,为研究EARP对微生物代谢的影响提供了理想的工具。近年来,EARP对MES中微生物的影响逐渐引起关注,但相关研究主要集中在微生物群落、污染物降解、微生物的少数基因或个别代谢途径,尚无全面系统性的EARP或电子受体其它物理化学特性影响微生物代谢的报道。自然状态下,电子受体往往是多种共存于同一体系中,然而已有的微生物代谢研究中多数是使用单一的电子受体,难以反映实际环境中微生物的呼吸代谢过程。本研究利用MES和RNA测序技术,结合脱色希瓦氏菌S12（Shewanella decolorationis S12）能以偶氮染料、电极等物质为电子受体进行呼吸代谢的特性,尝试研究电子受体物理化学特性以及共存电子受体对菌株S12代谢的全局性调控作用并揭示潜在的调控机制。主要得到以下结论:一、电子受体的氧化还原电位对S12的代谢具有全局性调控作用。研究利用MES、RNA测序技术比较分析了电极EARP为0.8 V（MES0.8）、0.2 V（MES0.2）和-0.2 V（MES-0.2）条件下对S12代谢的影响。理化及转录组数据分析表明S12的代谢活性与EARP无线性关系。转录组结果显示许多与能量产生、碳代谢、氨基酸合成运输、脂代谢等过程相关基因都表现出了EARP特异性。其中有少数细胞色素c表现出了EARP偏好性,但胞外电子传递链上的关键细胞色素c并没有显著性差异。鞭毛合成代谢和硫同化代谢途径在MES0.8条件下的显著性富集说明EARP高的条件下S12表现出了较强的电动性和氧化应激反应。完整的TCA途径在低电位（MES0.2和MES-0.2）条件下富集,而高电位（MES0.8）条件下乙醛酸循环途径得到富集。由此可见,EARP不只是调控了微生物的部分代谢途径或者几个关键基因,而是进行了全局性的调控作用。此外,EARP虽然对微生物的中心碳代谢途径有着重要的影响,但不是该途径的唯一决定性因素。二、EARP与电子受体的其他物化特性对S12代谢途径的调控具有差异性。通过分析S12利用O2（0.8 V）与具有相同电势的电极（MES0.8）为电子受体时S12代谢活性的差异性,揭示了除EARP以外电子受体的其它物理化学特性对S12呼吸代谢的影响。结果显示MES0.8、MES-0.2条件下S12的底物代谢活性显著低于好氧条件,且电子受体的其它物理化学特性比EARP对S12代谢的影响更大。好氧条件下,S12的完整TCA循环、氨基酸合成、细胞合成、硫代谢等途径的活性较高;厌氧MES0.8与MES-0.2条件下,氨基酸降解途径显著富集。分析表明厌氧电极呼吸条件下氨基酸降解途径在S12的呼吸代谢中发挥了重要作用。完整TCA循环途径的富集程度在各条件下的关系是好氧>MES-0.2>MES0.8。综合以上结果推测厌氧MES-0.2条件下只有小部分的碳源进行了完整TCA循环。相比于MES0.8和MES-0.2,硫同化代谢途径在好氧条件下显著富集上调,印证了硫同化途径是S12氧化应激的重要途径。三、共存电子受体对S12代谢途径进行全局性的调控是S12产电提高、苋菜红还原效率降低的根本原因。强极性偶氮染料苋菜红和电极可以分别代表可溶和不溶性两种胞外呼吸电子受体,且具有相近的氧化还原电位。研究比较分析了苋菜红、电极和二者共存条件下对S12代谢的调控作用。结果显示三组样品中,电极呼吸及共存电子受体呼吸条件下S12的转录谱较为接近,而与苋菜红还原条件下的转录谱中甲基受体趋化信号蛋白、碳代谢途径以及细胞色素c基因的表达存在显著性差异。S12分别以电极和共存电子受体呼吸时氧化磷酸化途径中某些基因的转录活性存在显著性差异,推测这些基因可能是特异性地参与了S12的电极呼吸过程。对上述分析中发现的特异性基因进行敲除并验证其功能。初步结果表明,电极呼吸条件下显著性上调表达的SHD2784基因是一个新发现的、重要的S12产电特异性基因,且不参与苋菜红还原。研究表明,胞外电子受体的溶解度、分子结构对S12的代谢有显著调控作用;共存电子受体条件下,S12会偏好利用某种电子受体,同时其代谢活性在一定程度上也被其他电子受体调控。综上所述,本研究首次从生理、转录组及功能基因层面系统地分析了EARP、电子受体的其它物理化学特性及共存电子受体对S12代谢的全局性调控作用,并初步确定了一个新的电极呼吸特异性基因。研究结论揭示了电子受体对细菌呼吸代谢过程的复杂调控机制,对现有微生物呼吸代谢的基础理论进行了重要补充;为基于微生物呼吸代谢的应用技术如生物修复、生物电化学技术的优化和开发提供了重要的科学理论指导。