先天性肾上腺皮质增生症(congenital adrenal hyperplasia,CAH)是一组常见的常染色体隐性遗传病,主要病因是由于类固醇激素合成过程中的关键酶酶受损导致的皮质醇合成障碍。CAH在全球的发病率约为1:10000-1:20000,各种族之间差异较大。在中国的发病率约为1:28000,略低于其他西方国家。由于CYP2A2基因发生缺陷而导致的21羟化酶缺陷症(21-hydroxylase deficiency,21-OHD)为最高发的一类,约占CAH的95%。21-OHD有三种临床分型,包括经典的失盐型(salt-wasting,SW)和男性化型(simple virilizing,SV),以及非经典型(nonclassical,NC)。患者的临床分型与基因型具有密切的联系。编码21羟化酶的CYP21A2基因位于6号染色体短臂上,与无功能的假基因CYP21P串联排列,二者外显子的同源性高达98%,CYP21A2基因的致病突变约有70-75%来源于真假基因重组,包括基因转化、缺失等。近些年越来越多与基因重组无关的自发突变也陆陆续续被报导,对CYP21蛋白的功能学研究具有很重要的意义。同时,对21-OHD患者的基因型与表型关系的分析也至关重要,可以为临床工作的中该疾病的产前诊断及遗传咨询提供理论依据。第一部分患者临床资料的收集及突变分析目的分析72例山东省21-OHD患者的临床特征及性激素水平,分析患者人群的热点突变频率,同时进行新突变的同源性分析。方法1.收集了 2012-2017年于山东省立医院就诊的72例21-OHD患者的临床资料,包括病历资料、实验室检查等,并对其进行详尽分析。2.留取患者外周全血,提取DNA后利用PCR技术对CYP21A2基因进行扩增,再利用MLPA技术结合Sanger测序对其进行检测并与正常参考序列进行比对,寻找致病突变。3.统计检测到的各个突变的详细信息,分析患者人群的热点突变频率。4.对本次研究发现的4个未被报道的新发CYP21A2基因突变进行同源性分析。结果1.72名患者中男性患者37人,女性患者35人,平均确诊年龄为3.5±7.6岁。其中有47人(65.3%)诊断为SW型,11人(15.3%)为SV型,14人(19.4%)为NC型。2.62.5%的患者皮肤呈现色素沉着,为最常见的临床症状。其他较为常见的临床症状有阴蒂肥大(37.5%)及外周性性早熟-阴茎提前发育(13.9%)。在56名婴幼儿患者中,最常见的症状为吐奶(42.9%)及体重不增长(12.5%)。3.共检测到25种突变类型,最常见的突变为I2G(32.6%),Large lesion(20.6%),I173N(17%)和Q319X(7.1%),其中还包含4个未被报导过的新突变:p.L199X,p.E321del,p.H393Q和p.L459_P464del,新突变的检出率为2.8%(4/141)。4.在Uniprot网站上获取多种哺乳动物(猪,牛,狗,猫及大鼠、小鼠)的CYP21蛋白序列,利用Pubmed网站的BLAST功能比对其与人的CYP21蛋白序列在321位、393位及459-464位氨基酸残基位点及其邻近位点的区别,发现氨基酸残基E321、H393、L459_P464均位于CYIP21蛋白的高度保守区域,而p.L199X造成CYP21蛋白截短。结论1.在72名中国21-OHD患者中,SW为最常见的临床分型,就诊的患者中最常见的症状为皮肤色素沉着,其中婴幼儿患者中最常见的症状为吐奶。2.72个患者中共检测到141个突变的等位基因,检出率为97.9%(141/144)。最常见的突变为I2G(32.6%),与之前欧美国家相关研究报道的突变分布情况相似。3.推测四种新发突变p.L199X,p.E321del,p.H393Q和p.L459_P464del均可能对CYP21蛋白的功能造成较为严重的影响。第二部分21-OHD基因型与临床表型的相关性分析目的探究72名患者基因型-临床表型之间的关系并复习文献,进一步研究之前文献报导过的国内CAH患者,为临床实践中产前诊断及遗传咨询提供依据。方法1.将72名21-OHD患者依照其基因型分为四组。2.分析各组之间基因型与表型关系,及基因型与激素水平关系。3.查阅文献,总结分析之前报导过的所有中国CAH患者的基因型-表型相关性。结果.1.在72名患者中共发现了 36种基因型。根据以往研究,取两个等位基因中较为轻微的致病突变作为分组依据,共分为四组:0组:12人;A组:26人;B组:16人;C组:11人。2.在基因型最为严重的0组中,所有12名患者均为与之对应的SW型;在A组中,26人中有23人(88.5%)为SW型,另外有1人(3.8%)为SV型,2人(7.7%)为NC型;在B组的16人中,SW型CAH有5人(31.3%),SV型和NC型分别有6人(37.5%)和5人(31.3%);在C组中,SW型CAH有2人(20%),SV及NC型CAH各有4人(40%)。3.在分析患者激素水平时发现,FSH的均值为2.52±2.51 IU/L,LH的均值为1.69±2.52 IU/L,远低于二者的正常值:FSH:5-40 IU/L,LH:5-25 IU/L。我们对FSH和LH进行了 ROC曲线分析,计算了曲线下面积(AUC),发现二者对最严重的SW分型CAH的预测作用的AUC值分别为0.862(CI(95%):0.735-0.943,P<0.001)和 0.669(CI(95%):0.522-0.796,P=0.0364)。结论1.在本研究中,临床症状较为严重的0组和A组中患者的基因型-表型的相关性最高,在0组和A组中对表型的阳性预测值分别高达100%和85%。然而B组和C组患者基因型-表型相关性一般,B组中仅有31.3%的患者为预测中的SV表型,C组中有36.4%为我们预测的NC型CAH。2.通过对之前报导过的487个病例进行归纳汇总,发现中国CAH患者的基因型与表型高度相关。3.FSH可以用于预测21-OHD的疾病严重程度。第三部分CYP21A2基因新突变(p.L199X,p.E321del,p.H393Q 及p.L459_P464del)的功能学分析目的为了明确在4名CAH患者中发现的四个CYP21A2基因的新发突变L199X,E321del,H393Q及L459_P464del的意义及其与临床分型的关系,我们对其进行了体外细胞实验研究及三维结构分析。方法1.以 pcDNA 3.1 为载体,构建 CYP21A2 的野生型质粒 pcDNA3.1-CYP21A2-WT,再在野生型质粒的基础上构建8种突变型质粒,其中4种突变为之前做过功能学研究的已知突变1173N,V282L,P454S和P483S,残存酶活性分别为4.4%,18%,24-38%,54-61%,作为对照作用以评估实验的准确性。另外四种为我们发现的新突变 L199X,E321del,H393Q 及 L459_P464del。2.将质粒转染COS-7细胞48小时后,在培养基中加入底物孕酮或17-羟孕酮,孵育1小时后提取培养基中的类固醇,检测产物DOC及11-DOC的产量,从而计算野生型及突变型CYP21蛋白的底物转化率。以野生型CYP21蛋白的转化率定义为100%,其他突变蛋白的转化率与其作比,用所得比值表示其对应的残存酶活性。3.以PDB网站上已解析出的人类CYP2J蛋白的三维结构模型-4Y8W为模板,利用软件PyMoL来构建CYP21蛋白的四种新突变模型,分析其结构和功能变化。结果1.四种已知对照突变I173N,V282L,P454S和P483S对孕酮的转化率分别为:9.5±2.4%,41.35±5.2%,48±2.4%,81.3±3.0%;对 17-羟孕酮的转化率分别为:9.0±0.6%,44.3±2.8%,55.9±2.3%,81.0±2.0%。2.四种新发突变L199X,E321del,H393Q,L459_P464del对孕酮的转化率分别为:0.9±0.7%,2.4±0.7%,2.2±0.6%,3.5±1.3%;对 17-羟孕酮的转化率分别为:1.1±0.4%,3.0±1.6%,2.5±0.6%,3.6±1.1%。3.对四种新发突变的三维结构分析结果示:突变L199X编码了截短蛋白,第199-485位的氨基酸残基缺失,从而丧失了蛋白与血红素及底物孕酮的结合位点,无法与二者结合从而严重影响酶的功能;野生型CYP21蛋白中,321位的谷氨酸与345位的亮氨酸存在氢键作用,从而维系蛋白正常的三维结构,而E321del突变后,谷氨酸的缺失导致此氢键作用消失,从而影响蛋白的三维结构;同理,393位的组氨酸与355位的精氨酸存在氢键作用,而组氨酸突变为谷氨酰胺后此氢键作用消失,影响三维结构从而影响蛋白功能;459-464位氨基酸残基的缺失将导致其与310位的组氨酸与475位的组胺酰胺的氢键作用缺失从而影响蛋白功能。结论1.四种已知对照突变的残存酶活性呈梯度递增的变化,趋势与之前多篇文献报导结果一致,侧面验证实验设计及实施过程均较为可靠。2.体外细胞实验检测到四种新突变都显著降低了相对应的CYP21蛋白的活性,四种新突变对孕酮及17-羟孕酮两种底物的转化率均小于5%。3.四种突变均导致CYP21蛋白的三维结构发生变化,影响蛋白功能,软件分析结果支持细胞实验结果。4.结合酶活性实验结果、三维结构分析及同源性分析推测四种突变对应的临床表型应均为SW型。