哺乳动物附植前囊胚中有三种类型的细胞:原始外胚层(EPI)细胞、原始内胚层(PE)细胞和滋养层(TE)细胞。其中,EPI和PE细胞均由内细胞团(ICM)细胞分化而来。EPI细胞将来发育为小鼠个体,以及羊膜、绒膜尿囊胎盘及脏卵黄囊的部分组织;PE细胞将来发育为脏卵黄囊和壁卵黄囊的部分组织;而TE细胞将来发育为壁卵黄囊和绒膜尿囊胎盘的部分组织。解析胚胎三胚层分化调控机制对于阐明早期胚胎来源干细胞多能性维持和未来临床应用具有重要意义。Krt8是组成细胞骨架中间纤维的角蛋白,本实验发现其在ICM细胞和TE细胞中表达存在明显差异。为此,本实验围绕Krt8对早期胚胎ICM和TE细胞分化调控机制展开。本实验利用单细胞微流控高通量qPCR技术分析了单倍体、二倍体和四倍体附植前不同发育时期胚胎单个卵裂球多个基因的表达谱。其中Krt8基因表达水平在单倍体和二倍体胚胎的24细胞时期有显著的差异。进一步统计囊胚发育率发现,单倍体囊胚发育率显著低于二倍体囊胚,但是在孤雌单倍体胚胎中注射外源Krt8 mRNA后,没有提高囊胚发育率。在二倍体胚胎中,Krt8在合子时期开始表达;在2-4细胞时期胚胎有丝分裂M期之前的卵裂球中,krt8蛋白表达丰度低;在有丝分裂M期开始后的卵裂球中,Krt8蛋白表达丰度高;随着胚胎发育,在桑椹胚时期,Krt8基因表达水平增强;在囊胚不同类型细胞中差异显著,ICM细胞中表达水平低,而TE细胞中表达水平高。此外,本实验还发现Krt8在TS细胞中表达水平高于ES细胞;在13.5 dpc的胎鼠中,Krt8在胎盘和胎膜中表达水平高于其他器官和组织。在二倍体合子时期注射siRNA敲降Krt8基因后发现,小鼠囊胚发育率降低;囊胚孵化能力降低;囊胚总细胞数和TE细胞数减少;Cdx2基因表达水平显著降低,同时囊胚时期线粒体膜电位降低;ATP含量降低;mtDNA拷贝数减少。通过质谱实验技术预测出Krt8和线粒体自噬、线粒体去极化和ATP结合蛋白等有显著相关性,其中包含Hk2蛋白等。mRNA测序结果也表明,敲降Krt8基因的囊胚中,Hk2基因表达水平降低。进一步通过qRT-PCR验证发现,敲降Krt8基因后,桑椹胚和囊胚时期的Hk2基因表达水平均显著降低。在TS细胞中敲降Krt8基因会导致TS细胞分化能力增强;Cdx2基因表达水平显著降低;线粒体膜电位降低;以及Hk2基因表达水平显著降低和蛋白表达丰度明显降低。结果表明,Krt8可能调控Hk2,进而影响胚胎的发育和分化。本实验结果进一步分析显示,Krt8基因在二倍体和四倍体附植前胚胎的表达谱相似,均为ICM细胞表达水平低,TE细胞表达水平高。和二倍体囊胚相比,四倍体囊胚EPI细胞显著减少,EPI细胞克隆集落形成能力显著降低。这表明,四倍体EPI细胞缺陷是EPI细胞克隆集落形成能力显著降低的原因。进一步对四倍体ES细胞研究表明,四倍体ES细胞同样能嵌合到附植前囊胚的ICM细胞中。在嵌合体胚胎6.5 dpc至10.5 dpc时期,四倍体ES和二倍体ES细胞有相似的嵌合部位,但是四倍体ES细胞嵌合效率和胎鼠存活效率均显著降低。综上所述,Krt8对胚胎TE细胞的发育有重要的作用。在krt8发挥功能过程中,可能通过Hk2对线粒体功能起到调节作用。