家蚕丝腺生物工厂表达hGM-CSF基因打靶载体的构建及应用研究

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家蚕(Bombyx mori)丝腺具有作为生物工厂的潜质,为了通过基因打靶实现外源基因在丝腺组织特异表达,克隆、并测定了fib-H基因启动子及其旁侧序列(DQ989298)、fib-H内含子和第二外显子部分序列(EU346954),结果显示,该2个片段与已公开的家蚕丝素重链基因(AF226688)对应区域的同源性分别达98.48%和99.58%;二级结构分析显示,启动子区域可形成多个可能与调控蛋白的识别和作用有关的茎环结构;将第2外显子对应的部分氨基酸序列与其他昆虫的丝蛋白进行比对分析,发现不同的丝蛋白在比对的区域具有潜在的GX3EX3TX1KX20-22X1VX3DX2GX1EX3EEDV守恒基序,可能对丝蛋白结构起到重要作用;利用克隆的丝素重链基因的2个片段作为同源臂,成功构建了带有A3启动子驱动GFP的表达盒、丝素轻链启动子驱动hGM-CSF打靶载体;体外翻译和体内瞬时表达结果显示,该基因打靶载体可以在后部丝腺组织匀浆中表达hGM-CSF,在丝腺可以检测到GFP的表达,有关结果为最终通过基因打靶在丝腺组织表达hGM-CSF奠定了基础。
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