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目的:
(1)研究视网膜外植体培养中Müller细胞的增殖能力,确定视网膜干细胞减少的时间过程。
(2)比较正常小鼠与视网膜退化小鼠(rd)视网膜Müller细胞体外增殖能力的差异,为视网膜退行性疾病的细胞治疗提供进一步的理论依据;
方法:
(1)分离不同发育时期的新生小鼠视网膜,剪碎,进行外植体离体培养,用Müller胶质细胞标记物GS(glutamine synthetase)和视网膜色素上皮细胞标记物RPE-65进行鉴定。用Brdu和Ki67标记增殖细胞,统计不同视网膜发育时期中处于增殖期Müller细胞的百分比。此外,通过添加外源性的细胞因子,诱导Müller细胞去分化形成神经球,统计其神经球数目。
(2)利用闪光视觉诱发电位产生的视网膜电图和切片HE染色来确定rd和野生型(WT)小鼠,分离成年小鼠视网膜,剪成小块后进行外植体培养,利用M试ler胶质细胞标记物GS和神经前体细胞标记物Nestin进行鉴定。并传代培养,统计每一代的细胞数。
结果:
(1) RT-PCR及免疫荧光染色结果显示,视网膜外植体培养的增殖细胞具有Müller胶质细胞的特征,无色素上皮细胞污染,并表达神经祖细胞标记基因Pax6,表明增殖的Müller具有神经祖细胞的特征。
(2)分离P7,P12,P20三个时期的视网膜,体外培养Müller细胞,通过免疫荧光染色计数发现,随着小鼠出生后年龄的增长,标记的Brdu和Ki67阳性细胞所占的百分比下降,神经球数目也有同样的趋势。
(3)传代培养rd和WT小鼠的视网膜Müller细胞,统计每一代的细胞数发现,rd小鼠视网膜Müller细胞数目明显多于WT小鼠,rd小鼠的Müller细胞随着传代不断增殖,而WT小鼠的视网膜Müller细胞数基本不变。
结论:
(1)视网膜外植体培养可以获得到具有神经祖细胞特性的Müller细胞,但随着小鼠年龄的增长特别是开眼后,其增殖能力逐渐下降;
(2)rd小鼠视网膜在成年后中,其外植体培养的Müller细胞仍然维持较高的去分化增殖能力。