研究背景与目的自噬仍是目前研究的热点,我们知道,自噬是细胞中一种依赖于溶酶体的极度保守的生理过程,是细胞内物质再循环的有效机制。自噬是一种多步骤的动态生理过程,包括5个部分:诱导、延伸、包裹、成熟、降解。自噬通过降解细胞内功能失调或不必要的细胞质成分(如内质网、线粒体等)帮助细胞应对不利环境(如饥饿、低氧、感染等),以此维持细胞内稳定。适度的自噬是细胞抵抗不良环境的保护机制,但出现过度自噬时,将引起细胞的死亡,称为自噬性死亡。研究发现死亡的细胞中可发现大量包裹着细胞质和细胞器的自噬溶酶体,胞质中绝大多数物质被降解,但细胞核依然保持完整性。研究发现许多重要蛋白或细胞因子对自噬均有调节作用,例如P53上调凋亡调节因子(PUMA)属于BH3蛋白家族的重要成员,其在诱导细胞凋亡中发挥重要作用。研究发现PUMA缺失使得小胶质细胞的数量明显减少,实验发现其可抑制小胶质细胞的自噬作用,并能抑制小胶质细胞中ERK的激活,进而减少胶质细胞凋亡,同时实验发现PUMA表达增高亦会增强小胶质细胞的自噬作用。目前大量研究发现信号通路亦对自噬有调节作用。研究较多的是Toll样受体通路与NOD通路,其中TLR2与TLR4通路甚多,其中TLR2表达于胶质细胞膜上,属于TOLL样家族一员,可激活小胶质细胞,研究发现TLR2的配体肽聚糖(PGN)能够通过激活自噬从而刺激小胶质细胞活化,诱发细胞死亡。有实验用PGN处理小胶质细胞后,BV-2小胶质细胞死亡明显增加。同时实验发现促炎因子如TNF-a、Fas配体浓度改变与细胞死亡关系不大,但3-MA能抑制细胞死亡,证明细胞凋亡非坏死性死亡,可能存在自噬性死亡。亦有实验通过建立TLR2缺陷小鼠模型发现,PGN处理小鼠后LC3Ⅱ的量没有增加,并且不能诱导这些小鼠脑细胞凋亡,实验初步表明PGN激活的小胶质细胞可能通过TLR2诱发细胞自噬及细胞死亡。研究证实自噬发生与炎症反应或免疫调控密切相关,它能平衡有益和不利的炎症作用或免疫反应,从而防止自身免疫病和炎症性疾病发生。小胶质细胞是一类重要的神经免疫细胞,在先天免疫反应中发挥重要作用,激活的小胶质细胞能释放各种细胞因子、神经营养因子,并可以诱导组织修复,发挥神经保护作用;但当小胶质细胞过度激活后,小胶质细胞会诱发炎症反应,并释放大量的细胞因子及神经炎症因子如:NO、IL-6、IL-1B、TNF-a、IL-10、Arg-1等,炎症因子的堆积导致中枢神经系统因氮氧失衡而使神经中毒。研究发现活化的小胶质细胞表达多样的功能状态,主要包括促炎M1和抗炎M2状态,M1状态下细胞表面标志物CD16/32、CD86、CD40表达增加,M2状态下细胞表面经典标志物CD206表达增多,不同的表型下小胶质细胞释放有差异的炎性化学因子。受体通路对自噬调节作用研究比较多,但深入的研究尚少,尤其自噬流对小胶质细胞表型转变作用实验研究甚少。本课题依据TLR2在发现微生物感染和激活炎症过程中的关键作用,研究自噬与TLR2通路在小胶质细胞激活状态下的关系,利用TLR2激动剂及拮抗剂证实其与小胶质细胞自噬的关系,并观察自噬流的强弱对小胶质细胞M1/M2表型的作用,进一步监测不同的表型变化对细胞存活的影响,探索新的脑细胞保护策略。有研究发现在成人神经系统感染中,诱导自噬的药物在临床治疗中可有获益。此类药物在儿童神经系统感染中的是否获益,尚无相关研究。本研究课题正是建立在小鼠颅内感染条件下,通过调节自噬水平观察对神经细胞存活的影响,在某种程度上可为此种猜想提供理论支撑,并为儿童链球菌脑膜炎的治疗提供前景。研究内容1.小胶质细胞TLR2通路激活与自噬发生关系的研究2.TLR2介导的自噬对小胶质细胞M1/M2表型转变及效应研究3.颅内感染下小胶质细胞自噬对鼠神经细胞生存作用的研究研究方法体外1.不同浓度的PGN共培养小胶质细胞,取不同的时间点免疫印迹法检测自噬相关蛋白LC3Ⅰ/Ⅱ、Beclin-1表达水平,筛选PGN实验浓度及检测时间点。2.筛选siTLR2干扰序列敲除基因,免疫印迹法评估处理后的TLR2受体蛋白表达水平。3.设立siTLR2处理组与PGN刺激组,免疫印迹法验证TLR2-KO后自噬相关蛋白LC3Ⅰ/Ⅱ、Beclin-1表达水平。4.免疫荧光法标记siTLR2处理组与PGN处理组自噬蛋白LC3B,共聚焦显微镜观察评估自噬蛋白表达水平,佐证TLR2通路与自噬关系。5.设立空白对照组、实验组、Pam3CSK4处理组、CU-CPT22处理组,免疫印迹法测定自噬相关蛋白LC3Ⅰ/Ⅱ、Beclin-1表达水平,观察受体调节剂对自噬的影响。6.免疫荧光法标记各组LC3B与LAMP-1蛋白,共聚焦显微镜下观察自噬流强弱,荧光MERGE后观察并计算自噬体发生数量。7.ELISA法检测M1型相关因子TNF-a、IL-6及特异性标志物CD86表达水平,检测M2型相关因子IL-10、Arg-1及特异性标志物D206表达水平,观察自噬强弱对细胞表型转变的影响。8.凋亡试剂盒Annexin V-PE/7AAD标记小胶质细胞,流式细胞仪检测细胞凋亡水平。体内1.慢病毒转染敲除TLR2基因建立TLR2-KO小鼠模型2.设立空对照组、实验组、TLR2-KO组、3-MA处理组,取脑组织制作石蜡切片,用CD11b与LC3B免疫荧光标记观察并计数小胶质细胞发生自噬数量。3.尼氏染色观察并计数神经细胞凋亡4.小鼠脑组织感染模型中脑组织含水量检测5.小鼠脑组织感染模型中神经功能的检测研究结果1.小胶质细胞TLR2通路激活与自噬发生关系的研究1.1不同浓度的PGN感染小胶质细胞后自噬水平测定实验为获取PGN最佳实验浓度及自噬检测时间点,PGN设定3个浓度梯度,在体外感染BV-2细胞后,于培养的第12小时,第24小时采用WESTBLOT检测自噬相关蛋白表达水平,实验发现在24小时自噬表达水平较12小时明显增强,且PGN浓度15μg/ml时自噬表达较强。1.2筛选siRNA干扰序列敲除TLR2基因,抑制TLR2蛋白表达为敲除TLR2基因,选择合适的小RNA干扰序列,实验从3组不同的干扰序列中筛选最佳序列,3组序列分别加入BV-2细胞培养板中,培养48小时后,采用WESTBLOT方法检测TLR2蛋白表达水平,结果提示序列3对TLR2蛋白表达抑制明显。1.3 PGN感染小胶质细胞后,敲除TLR2通路抑制自噬表达为研究自噬水平与TLR2通路之间的关系,实验设立小干扰RNA敲除TLR2+PGN实验组,同时设立PGN组及空白对照,24小时后WESTBLOT方法检测自噬相关蛋白LC3Ⅰ/Ⅱ、Beclin-1表达水平,并用GFP-LC3免疫荧光观察各组自噬水平,结果提示PGN组自噬水平明显增强,绿色荧光标记细胞内自噬斑块形成明显增多,相反TLR2-KO组自噬蛋白表达无明显增强。实验表明敲除TLR2通路后,自噬水平不能增强。2.TLR2介导的自噬对小胶质细胞M1/M2表型转变及效应研究2.1 TLR2激动剂/拮抗剂体外调节自噬表达水平实验加入TLR2调节剂Pam3CSK4及CU-CPT22,培养24h时后免疫印迹检测自噬强度,结果显示Pam3CSK4增强TLR2受体表达,增强自噬相关蛋白LC3Ⅰ/Ⅱ、Beclin-1表达水平;CU-CPT22降低TLR2受体表达,并降低自噬蛋白表达水平。实验同时采用LC3B荧光抗体(绿色)与LAMP-1荧光抗体(红色)观察自噬流强弱,MERGE后观察自噬体发生量,结果提示PGN+Pam3CSK4组自噬流明显增强,CU-CPT22处理组自噬流明显减弱。2.2 TLR2介导的自噬调控小胶质细胞M1/M2表型转变为研究自噬强弱对小胶质细胞表型的作用,ELISA法检测M1(TNF-a、IL-6、CD86),M2(IL-10、Arg-1、CD206)表达程度,其中CD86为M1特异性表型标志物,CD206为M2特异性表型标志物,结果显示PGN+Pam3CSK4组自噬明显增强,小胶质细胞表型向M1型转变明显,促炎倾向突出,M2标志物及相关因子均受到抑制;PGN+CU-CPT22组结果显示小胶质细胞表型向M2型转变,M1型相关蛋白表达明显减少。2.3 自噬引发的小胶质细胞表型转变影响细胞存活,M1促进凋亡为观察表型转变对小胶质细胞存活的影响,实验采用Annexin V-PE/7AAD标记流式细胞仪检测细胞凋亡,自噬增强组细胞凋亡增加,凋亡程度与M1型促炎增强一致,实验结果说明自噬明显增强后促进细胞向M1型转变,细胞凋亡增加。3.颅内感染下小胶质细胞自噬对鼠神经细胞生存作用的研究3.1 TLR2-KO及自噬抑制剂在体内对自噬表达的影响实验采用慢病毒转染法敲除鼠TLR2受体,实验设计为4组,各实验组均通过侧脑室定位注射的方法注药(PGN、PGN+3MA,安慰剂),48小时后荧光显微镜下观察小胶质细胞发生自噬的数量,实验表明,PGN组发生自噬数量明显最多,TLR2-KO组及自噬抑制剂3-MA组自噬发生数量明显减少,结果提示TLR2-KO影响自噬表达。3.2自噬对神经细胞损伤的作用实验采用尼氏染色方法观察各组细胞存活情况,实验发现PGN组神经细胞死亡及损伤最多,TLR2-KO组及自噬抑制剂3-MA组细胞受损明显较PGN组减少。说明抑制TLR2通路或自噬抑制对神经细胞有保护作用。3.3小鼠脑组织感染模型中脑组织含水量检测TLR2-KO及自噬抑制剂3MA组中脑组织含水量无明显差异,而在PGN组,脑组织含水量明显增加,TLR2-KO组及自噬抑制剂组可以有效减少脑组织含水量。3.4小鼠脑组织感染模型中神经功能的检测TLR2-KO及自噬抑制剂组中鼠神经功能无明显差异,而在PGN组,小鼠的神经功能受损,TLR2-KO及自噬抑制剂均可有效降低小鼠的神经功能受损情况。研究结论1、PGN在体外和体内均可激活TLR2信号通路并诱导小胶质细胞发生自噬。2、TLR2通路激活可上调自噬,干扰TLR2基因表达后,自噬水平受到抑制。3、自噬可调控小胶质细胞表型转变,增强自噬小胶质细胞向M1型转变,促进细胞死亡,抑制自噬小胶质细胞向M2型转变,促进细胞存活。4、在体外与体内,外源性PGN刺激下抑制自噬或敲除TLR2基因后可减少神经细胞损伤,有利于神经细胞存活,增强自噬促进细胞死亡。