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目的通过检测淡豆豉自然炮制中不同时间点黄曲霉毒素（Aflatoxin,AFT）含量、筛选鉴定和定量产AFT菌（简称产毒菌）并测定其产毒能力,考察黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1,AFB1）拮抗菌的拮抗能力,初步分析产毒菌和拮抗菌在AFB1消长中的作用,为探讨淡豆豉炮制中黄曲霉毒素消长机制奠定基础,并为淡豆豉或其它发酵中药和食品中黄曲霉毒素的防控措施提供科学依据。方法一、淡豆豉自然炮制中AFT含量测定1、淡豆豉自然发酵炮制:本实验室前期按2020年版《中华人民共和国药典》简称《中国药典》已建立规范的淡豆豉炮制工艺,本研究按此工艺制备淡豆豉,获取淡豆豉不同炮制时间点的样本和成品淡豆豉。2、建立超高效液相色谱串联质谱法（Ultra Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry,UPLC–MS/MS）,测定淡豆豉不同炮制时间点样本中AFT的含量。二、淡豆豉自然炮制中产毒菌的筛选、鉴定、定量和产毒能力1、淡豆豉自然炮制中产毒菌的筛选和鉴定（1）产毒菌的筛选和菌落计数:根据AFT在紫外光照射下可发生蓝紫色或绿色荧光的原理,筛选分离出产生蓝紫色或绿色荧光的微生物并进行菌落计数。将产荧光菌初步定义为产毒菌。（2）产毒菌的初步鉴定:通过肉眼观察菌落形态和显微镜观察镜下形态结构初步鉴定产毒菌。（3）产毒菌的分子生物学鉴定:提取各产毒菌的DNA,应用18Sr DNA序列进行PCR扩增、对扩增产物进行基因测序分析,查找模板基因序列,构建系统发育树,对产毒菌进行鉴定。2、产毒菌的产毒能力考察应用UPLC–MS/MS法测定产毒菌发酵液中AFT含量,比较它们产AFT的能力。三、考察淡豆豉炮制中AFB1拮抗菌的拮抗能力（本实验室前期从淡豆豉炮制中分离鉴定出已报道能抑制AFT产生的5株有益菌（简称拮抗菌）如枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis,JX2）、鲑色锁掷酵母菌（Sporidiobolus salmonicolor,EJ1）、黑曲霉菌（Aspergillus niger,FC2）、屎肠球菌（Enterococcus faecium,BR5）、鸟肠球菌（Enterococcus avium,9R2）,分别考察这5株菌抑制产毒菌生长和降解AFB1的的拮抗能力）1、5株待测菌对产AFT黄曲霉标准菌生长繁殖的影响平板对峙法检测待测菌对产AFT黄曲霉生长的影响:取待测菌的种子液分别接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）等距的四端,在平皿中央接种黄曲霉标准株孢子悬浮液,以只接种黄曲霉标准株孢子悬浮液的平皿作对照,常规真菌培养条件下培养一定时间后,测定各平皿中黄曲霉标准株的菌落直径,计算抑菌率。抑菌率=（对照组黄曲霉菌落直径-实验组黄曲霉菌落直径）/对照组黄曲霉菌落直径×100%。2、5株待测菌发酵上清液对产AFT黄曲霉标准株生长的影响取各待测菌的发酵上清液分别PDA培养基混匀倒入平皿中,以未加发酵上清液的PDA培养皿作为对照组,待凝固后于平皿中央接种等量的产AFT黄曲霉标准株孢子悬浮液,常规真菌培养条件下培养一定时间后,测定各平皿中黄曲霉标准株的菌落直径,计算抑菌率。抑菌率=（对照组黄曲霉菌落直径-实验组黄曲霉菌落直径）/对照组黄曲霉菌落直径×100%。3、5株待测菌对AFB1的降解能力在培养液中分别接种5株待测菌与相同浓度AFB1标准品进行摇床培养（以只加相同浓度AFB1标准品、未接种待测菌的培养液作对照）,摇床培养一定时间后,离心,取上清液,用UPLC–MS/MS检测上清液中的AFB1含量。AFB1降解率（%）=（对照组AFB1含量-试验组AFB1含量）/对照组AFB1含量×100%。结果一、淡豆豉炮制和取样淡豆豉炮制过程中每3天取样一次,“黄衣上遍”阶段分别为记为发酵0天、发酵3天、发酵6天,“再闷”阶段分别记为再闷3天、再闷6天、再闷9天、再闷12天、再闷15天和蒸后成品,编号分别为F0、F3、F6、Z3、Z6、Z9、Z12、Z15和Z蒸。二、淡豆豉自然炮制中不同时间点4种AFT（黄曲霉毒素B1,AFB1;黄曲霉毒素B2,AFB2;黄曲霉毒素G1,AFG1;黄曲霉毒素G2,AFG2）含量测定结果使用UPLC–MS/MS法测定4种AFT含量,方法学考察良好,表明此方法适合于淡豆豉中的AFT含量测定;测定结果表明AFT的含量在淡豆豉自然炮制过程中呈动态变化。1、建立了淡豆豉中4种AFT含量测定的UPLC–MS/MS方法样品处理和免疫吸附前处理请加上去使用超声提取法提取样品中的黄曲霉毒素以及使用免疫亲和柱对样品进行净化。（1）线性关系考察:以各浓度（ng/m L）标准品为横坐标x,对应的峰面积为纵坐标y,计算得出AFB1的标准曲线方程为y=402087x+7996.2,r=0.9998;AFB2的标准曲线方程为y=58257x+1241.8,r=0.9997;AFG1的标准曲线方程为y=331396x-6075.6,r=0.9999;AFG2的标准曲线方程为y=29342x+92.996,r=0.9998。表明标准品浓度在0.05–20 ng/m L之间线性关系良好。（2）重复性考察:AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的相对标准偏差（Relative standard deviation,RSD）（n=6）分别为0.40%,0.43%,0.93%,0.49%,表明重复性良好（3）精密度考察:AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的相对标准偏差（Relative standard deviation,RSD）（n=6）分别为0.67%,2.01%,0.77%,2.59%,说明精密度良好。（4）加样回收率考察:AFB1、AFG1加入量为5 ng/g,AFB2、AFG2加入量为1.25 ng/g时,AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的平均回收率分别为97.5%,99.5%,98.2%,99.2%,RSD分别为2.32%,2.70%,0.5%,2.64%（n=6）;AFB1、AFG1加入量为1.16 ng/g,AFB2、AFG2加入量为0.29 ng/g时,AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的平均回收率分别为102%,94%,92%,90.6%,RSD分别为2.24%,1.33%,1.83%,1.56%（n=6）,表明回收率良好。2、4种AFT含量测定:淡豆豉自然炮制过程中各样本AFT含量呈先上升后下降的趋势:从发酵第3天开始逐渐上升,到再闷第6天达到最高值,为6.95μg/kg,之后开始下降,在再闷第9天下降至1.2μg/kg,再闷第12天后各样本的AFT含量均为0。三、淡豆豉自然炮制中产毒菌的筛选、鉴定、定量和产AFT能力筛选出15株产毒菌,经形态学和分子生物学鉴定分别为黄曲霉和溜曲霉;对产毒菌进行菌落计数,结果显示淡豆豉炮制过程中产AFT菌数量呈动态变化,在发酵第6天达到最大值;淡豆豉炮制过程中各产毒菌的产毒能力较弱（小于5ng/m L）,远低于黄曲霉标准株的产毒能力（654.90 ng/m L）,并且15株产毒菌的产AFT能力各不相同。1、产毒菌的筛选与菌落计数:根据AFT在紫外光照射下可发生蓝紫色或绿色荧光的原理,筛选分离出产生蓝紫色的微生物共15株,分别为黄曲霉和溜曲霉。产毒菌菌落数呈先上升后下降的趋势,从发酵第3天开始逐渐上升,到发酵第6天菌落数最多,为1x106.30CFU/g,之后开始减少,从再闷第9天开始没有检测到产荧光反应微生物。2、产毒菌的鉴定（1）传统微生物学方法鉴定:对筛选到产毒菌进行平板培养,肉眼和显微镜观察其形态结构,初步鉴定为黄曲霉与溜曲霉。（2）分子生物学方法鉴定:对产毒菌进行鉴定,鉴定结果:F6–1d、F6–2d、F6–3d、F6–4d、F6–5d、F6–6d（为发酵第6天样本中筛选到的产生荧光反应的菌株）、F3d（发酵第3天筛选到的产生荧光反应菌株）、Z6d（为再闷第6天筛选到的产荧光反应菌株）、Z3–5d、Z3–2d为黄曲霉（Aspergillus flavus）,Z3–1d、Z3–3d、Z3–4d、Z3–6d、Z3–7d（为再闷第3天筛选到的产荧光反应菌株）为溜曲霉（Aspergillus tamarii）。3、各产毒菌株的产毒能力（1）建立了发酵液中AFT含量测定的UPLC–MS/MS检测方法线性关系考察:以各浓度（ng/m L）标准品为横坐标x,对应的峰面积为纵坐标y,AFB1的标准曲线方程为y=402087x+7996.2,r=0.9998;AFB2的标准曲线方程为y=58257x+1241.8,r=0.9997;AFG1的标准曲线方程为y=331396x-6075.6,r=0.9999;AFG2的标准曲线方程为y=29342x+92.996,r=0.9998。重复性考察:AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的相对标准偏差（Relative standard deviation,RSD）分别为2.08%、3.50%、1.18%、1.66%（n=6）,表明重复性良好。加样回收率考察:AFB1、AFG1加入量为5 ng/m L,AFB2、AFG2加入量为1.5 ng/m L时,AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的平均回收率分别为94.53%、92.53%、94.87%,91.47%,RSD分别为1.01%,1.80%,1.60%,2.20%（n=3）;AFB1、AFG1加入量为2 ng/m L,AFB2、AFG2加入量为0.6 ng/m L时,AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的平均回收率分别为92.83%、93.33%、92.83%、92.0%,RSD分别为1.12%、2.47%、1.89%、2.17%（n=3）,表明回收率良好。（2）产毒菌发酵液中AFT含量测定采用UPLC–MS/MS法检测产荧光现象微生物在发酵液中AFT的含量,结果显示,15株产荧光反应的微生物中有5株不产生AFT,10株产生AFT,AFT含量在2.0–4.10 ng/m L之间。四、淡豆豉炮制中AFB1拮抗菌的拮抗能力本实验室前期从淡豆豉炮制中分离鉴定出文献已报道能抑制AFT产生的5株菌（简称拮抗菌）如枯草芽孢杆菌（JX2）、鲑色锁掷酵母菌（EJ1）、黑曲霉菌（JC2）、屎肠球菌（BR5）、鸟肠球菌（9R2）,考察这5株AFB1拮抗菌的拮抗能力。结果显示这5株菌对产AFT黄曲霉标准株生长均有一定的抑制作用,其中鲑色锁掷酵母菌的抑制作用最强;鲑色锁掷酵母菌对AFB1的降解作用最强。1、5株待测菌种子液对产毒黄曲霉标准株生长的影响:结果显示5株菌种子培养液对产毒黄曲霉生长均有一定的抑制作用,其中鲑色锁掷酵母菌对黄曲霉生长的抑制作用最强,抑制率达64.29%,屎肠球菌、鸟肠球菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉对黄曲霉生长的抑制率均在30%左右。2、5株待测菌发酵上清液对产毒黄曲霉菌生长的影响:结果显示,5株待测菌发酵上清液对产毒黄曲霉生长均有一定的抑制作用,其中屎肠球菌的抑制作用最强,抑制率为29.63%。3、5株待测菌对AFB1的降解作用:结果显示5株菌发酵菌液均对AFB1有一定的降解作用,其中鲑色锁掷酵母菌对AFB1的降解作用最强,达43.65%,黑曲霉菌的降解作用最弱。结论1、建立了UPLC–MS/MS法测定淡豆豉中AFT含量,该方法简单,快速,灵敏度高。淡豆豉炮制过程中AFT含量呈动态变化,进一步证实了淡豆豉“再闷”的重要性和“再闷”时间的合理性,2、淡豆豉炮制过程中存在产AFT的曲霉菌,为黄曲霉和溜曲霉,黄曲霉占大多数。产AFT菌呈动态变化,呈现先升高后下降的趋势。3、淡豆豉炮制过程中存在抑制产AFT的产毒菌生长和降解AFB1的拮抗菌。4、淡豆豉炮制过程中产AFT菌和拮抗菌相互作用,交替更迭,导致淡豆豉炮制过程中AFT呈动态变化,炮制至再闷后期和淡豆豉成品不含AFT,为揭示淡豆豉炮制中黄曲霉毒素消长机制奠定基础,并为淡豆豉黄曲霉毒素的防控措施提供科学依据。