晕船的防治历来是各国海军医学和航海医学领域研究的重点问题。服用药物是当前常用的防治晕船措施。然而,现有的抗晕药物多因存在嗜睡等副作用而使其在航海作业,尤其在军事航海作业中的应用受到限制。因此,筛选副作用小、有效的抗晕船药物一直是军事航海医学的研究重点之一有研究者发现,运动病的发生可能与异常加速度刺激下机体应激不足有关,并提出提高机体应激水平可能产生缓解运动病严重程度的作用。上个世界八十年代美国航空航天局研究结果证实,外源性糖皮质激素确实可以显著提高人体科里奥利加速度耐受能力。然而,大剂量或反复使用糖皮质激素可能对人体健康产生不利的影响。另外,糖皮质激素是否可用于提高机体晕船耐受力,尚未见报道。有意义的是,近年来有研究发现,人参皂苷可提高地塞米松缓解放化疗病人呕吐药效,并可缓解单独使用地塞米松的副作用。综合上述研究资料,提示联合应用糖皮质激素和人参皂苷可能具有预防或减轻晕船的作用,并在一定程度减轻单独使用糖皮质激素的副作用。本课题试图通过动物实验对糖皮质激素联合人参皂苷的抗晕船作用及其机制进行初步探索。第一部分常用大鼠晕船判断指标的比较目的：在统一实验条件下通过重复实验,对目前几种常用大鼠晕船判断指标的准确性和可重复性进行比较。1.材料与方法1.1实验动物分组及处理雄性SD大鼠(购自上海西普尔-必凯公司),体质量(180±20)g。按体重随机分为空白对照组(CON)、生理盐水+旋转刺激组(SAL),东莨菪碱+旋转刺激组(SCO),每组12只。动物饲养室环境温度22℃±2℃,湿度50%～60%；单笼饲养,自由摄食饮水,自然昼夜节律变化光照。SCO组大鼠灌喂东莨菪碱(购自广州环叶制药有限公司)水溶液(1 mg/kg体质量)；CON及SAL组大鼠灌喂等体积(lml/100g体质量)生理盐水。各组大鼠灌喂均为1次/d,模拟晕船刺激3 d中连续灌喂。1.2模拟晕船大鼠模型制作模拟晕船刺激装置根据Crampton等的报道仿制而成。将大鼠无束缚地放入该装置的有机玻璃笼内,进行角加速度刺激。刺激的方式为：绕水平轴顺时针旋转,以16°角加速度加速,达最大速度120°/s2后,立即以48°/s2的角加速度减速,直至旋转停止为1个旋转周期,每周期时间均为10s,1h/d×3d。另外,将对照组大鼠置于旋转刺激装置旁1h/d×3d。1.3高岭土摄入量高岭土(中国高岭土公司提供)：阿拉伯胶(国药集团上海试剂有限公司)：水(100g:1g:20 mL, w/w/v,质量/质量/体积),制成颗粒饲料状,放入饲料盒。每日定时称量,分别记录大鼠模拟晕船刺激前1d和刺激3d中每天的高岭土摄入量。1.4晕反应指数模拟晕船刺激前1d将各组大鼠无束缚地放入Crampton旋转器内(不旋转)1h后,立即记录实验大鼠立毛颤抖情况,并计量其在旋转器内的排便排尿量,按如下评分标准计算晕反应指数,晕反应指数评分为各项计分的总和。大鼠晕反应指数评分标准：排粪(粒)无,0分；有,每粒计1分；排尿无,0分；有,计1.2分；立毛无,0分；轻度,0.6分；重度,1.2分；颤抖无,0分；有,1.2分。每次模拟晕船刺激1h后,重复上述评分。1.5自发活动量模拟晕船刺激前1d将各组大鼠置于长,宽各40 cm,高80 cm,底面被分成面积相等的16块正方形格子,周壁为黑色的旷场里,用摄象机记录动物3 min内的大鼠总活动路程和活动时间。每次模拟晕船刺激后,立即重复上述实验。1.6大鼠前庭核c-fos蛋白表达量检测将各组大鼠在模拟晕船刺激1h后,立即断头取前庭核放于-80℃冰箱保存。提取前庭核蛋白,经考马斯亮蓝染色测定蛋白含量后进行SDS-PAGE凝胶电泳,电转移至硝酸纤维素膜,5%BSA(溶于0.1% TBST)封闭过夜,依次加入兔抗大鼠c-foS、P-actin一抗,辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗后显影。使用Quantity One软件对X光片进行灰度扫描及分析,以fos蛋白表达与actin条带密度值之比值作为各组fos蛋白的相对表达量。2.结果2.1模拟晕船刺激对大鼠高岭土摄入量的影响实验重复3次。实验1结果显示：实验期间内,SAL组高岭土摄入量显著高于SCO组和CON组,而SCO组和CON组间差异不显著。与刺激前(Before Exposition)比较,第1天(One-day Exposition)、第2天(Two-day Exposition)、第3天(Three-day Exposition)刺激后SAL组高岭土摄入量显著升高(P<0.05),并随着刺激天数的增加呈下降趋势；SCO组及CON组大鼠的高岭土摄入量变化不显著。但是,实验2及实验3结果显示：实验期间内,各组大鼠高岭土摄入量均无统计学差异。2.2模拟晕船刺激对大鼠晕反应指数的影响实验1结果显示：实验期间内,SAL组大鼠晕反应指数显著高于SCO组和CON组,并且随着实验天数的增加呈下降趋势。实验2及实验3结果与实验1结果一致。2.3模拟晕船刺激对大鼠自发活动的影响实验1和实验2的结果均显示：实验期间各组大鼠的自发活动情况随着实验天数的增加呈下降趋势。然而,实验1,3中SCO组大鼠自发活动总路程和总时间显著低于CON组,实验2中SCO组大鼠自发活动总路程和总时间又显著高于CON组。另外,实验1,2中CON组及SAL组之间无显著差异,实验3中CON组自发活动总路程及总时间显著高于SAL组。2.4模拟晕船刺激对大鼠前庭核c-fos蛋白表达量的影响与CON比较,SAL组大鼠前庭核c-fos蛋白表达显著增加(p<0.001),SCO组大鼠前庭核c-fos蛋白表达量显著增加(p<0.01)。同时,SCO组蛋白表达量显著低于SAL组(p<0.01)。第二部分糖皮质激激素对大鼠模拟晕船刺激耐受能力的影响目的：观察糖皮质激素对大鼠模拟晕船刺激耐受能力的影响,并探索地塞米松提高模拟晕船刺激大鼠耐受力的有效剂量。1.材料与方法：1.1实验动物分组及处理1.1.1双侧肾上腺切除对模拟晕船刺激大鼠耐受能力的影响：参照文献方法,雄性SD大鼠,体质量(180±20)g。按体质量随机分为肾上腺切除+生理盐水组(AS)、肾上腺切除+糖皮质激素组(AD),假手术+生理盐水组(SS),假手术+糖皮质激素组(SD),每组8只。其他饲养条件同上。适应性饲养4d后各组大鼠用10%水合氯醛麻醉,沿背部正中胸腰椎交界处剪开皮肤2±0.1cm,切除双侧肾上腺(假手术组大鼠除不切除双侧肾上腺),术后恢复1周后进行实验。AG及SG组大鼠灌喂地塞米松水溶液(0.5 mg/kg体质量)；AS和SS组大鼠灌喂等体积生理盐水。各组大鼠灌喂均为1次/d,连续3 d。1.1.2地塞米松提高模拟晕船大鼠耐受能力剂量观察：雄性SD大鼠,体质量(180±20)g。按体质量随机分为空白对照组(CON)、生理盐水晕船组(SAL)、东莨菪碱晕船组(SCO)、低剂量地塞米松晕船组(DEXL)、中剂量地塞米松晕船组(DEXM)、高剂量地塞米松晕船组(DEXH)每组8只。SCO组大鼠灌喂东莨菪碱水溶液(1.0 mg/kg体质量)；高、中、低地塞米松组大鼠灌喂地塞米松(Sigma美国)水溶液(分别0.1 mg/kg、0.5 mg/kg、1.0 mg/kg体质量)；CON和SAL组大鼠灌喂等体积生理盐水。各组大鼠灌喂均为1次/d,连续3 d。1.2模拟晕船刺激方法,同前。1.3晕反应指数、前庭核c-fos蛋白检测方法,同前。1.4大鼠体增重观察方法：每日上午8点用精度为0.1 g的电子秤秤量大鼠体质量,将第二天体质量减去前一天体质量即为该大鼠当天的体增重(g/d)2.结果：2.1双侧肾上腺切除对模拟晕船大鼠晕反应指数的影响与AS组比较,AD组、SS组、SD组大鼠晕反应指数显著下降(P<0.05,P<0.01)；与SS组比较,AD组大鼠晕反应指数无显著性差异(P>0.05),SD组显著下降(P<0.01)。2.2双侧肾上腺切除对模拟晕船大鼠前庭核c-fos蛋白表达量的影响与AS组比较,AD组、SS组、SD组大鼠前庭核c-fos蛋白表达量显著下降(P<0.01)：与SS组比较,AD组大鼠大鼠前庭核c-fos蛋白表达量无显著性差异(P>0.05),SD组显著下降(P<0.01)。2.3地塞米松对模拟晕船大鼠晕反应指数的影响与CON组比较,SAL组、SCO组、DEXL组、DEXM组,DEXH组晕反应指数晕反应指数显著升高(P<0.05,P<0.01)；与SCO组比较,DEXL组,DEXH组晕反应指数显著升高(P<0.05,P<0.01),DEXM组无显著性差异(P>0.05)。2.4地塞米松对模拟晕大鼠前庭核c-fos蛋白表达量的影响与CON组比较,SAL组、SCO组、DEXL组、DEXM组,DEXH组c-fos蛋白表达显著升高(P<0.01)；与SCO组比较,DEXL组,DEXH组蛋白表达显著升高(P<0.05, P<0.01),DEXM组无显著性差异(P>0.05)。2.5地塞米松对模拟晕船大鼠体增重的影响实验期间,生理盐水组,东莨菪碱组大鼠体增重与暴露前相比无显著性差异,地塞米松各给药组与暴露前相比体质量均显著性降低,其中,地塞米松高剂量组下降值最低(P<0.01)。第三部分地塞米松联合人参皂苷对模拟晕船大鼠耐受能力的影响及其机制研究目的：观察地塞米松联合人参皂苷对模拟晕船大鼠耐受能力的影响,并初步探讨其可能的作用机制1.材料与方法1.1实验动物分组及处理1.1.1地塞米松联合人参皂苷对模拟晕船大鼠耐受能力影响：雄性SD大鼠,体质量(180±20)g。按体质量随机分生理盐水组(SAL)、东莨菪碱组(SCO),人参皂苷组(GIN),地塞米松组(DEX),低剂量地塞米松+人参皂苷组(DEX+GIN)每组10只。其他饲养条件同上。SCO组大鼠东莨菪碱灌喂方法和剂量同前；DEX组大鼠灌喂地塞米松水溶液(0.5 mg/kg体质量)；GIN组大鼠灌喂人参皂苷溶液(1.5 mg/kg体质量)；DEX+GIN组大鼠灌喂地塞米松(0.3 mg/kg体质量)+人参皂苷水溶液(1.5mg/kg体质量)；SAL组大鼠灌喂等剂量生理盐水。各组大鼠给药均为1次/dX3 d。1.1.2地塞米松联合人参皂苷提高模拟晕船大鼠耐受能力机制探：雄性SD大鼠,体重(180±20)g。按体重随机分为肾上腺切除+生理盐水+模拟晕船刺激刺激组(ASM)假手术+生理盐水+模拟晕船刺激刺激组(SSM),假手术+糖皮质激素联合人参皂苷+模拟晕船刺激刺激组(SGM),肾上腺切除+生理盐水+无刺激组(ASC),假手术+生理盐水+无刺激组(SSC),假手术+糖皮质激素联合人参皂苷+无刺激组(SGC)每组10只。其他饲养条件同上。SGM组、SGC组大鼠灌喂地塞米松和人参皂苷水溶液(分别为0.3 mg/kg体质量和1.5 mg/kg体质量)；其余各组大鼠灌喂等体积生理盐水。其余各组大鼠灌喂相应的药物,剂量同前,灌喂1d后进行模拟晕船刺激1h后立即断头处死,取相应的脑组织备用。1.2模拟晕船刺激大鼠晕反应指数、自发活动观察方法、前庭核c-fos蛋白表达检测方法及体增重观察方法均同前。1.3大鼠下丘脑组胺、前庭核组胺含量及下丘脑组胺脱羧酶活力测定方法应用ELISA法,参照试剂盒说明书进行。1.4大鼠下丘脑组胺脱羧酶mRNA检测方法实时定量PCR法。2、结果：2.1地塞米松联合人参皂苷对模拟晕船刺激大鼠晕反应指数的影响刺激前各组大鼠的晕反应指数评分没有明显差异；连续3 d每天1 h加速度刺激后各组大鼠的晕反应指数评分与其刺激前相比均有大幅度升高(P<0.01)。刺激3d后,SCO、DEX和DEX+GIN组大鼠晕反应指数评分均明显低于SAL,其中DEX+GIN组晕反应指数评分最低(P<0.01),而GIN组晕反应指数评分与SAL组比较无显著性差异。2.2地塞米松联合人参皂苷对模拟晕船刺激大鼠前庭核c-fos蛋白表达的影响与SAL组比较,SCO、DEX、DEX+GIN组大鼠c-fos蛋白表达显著下降(P<0.01),GIN组无显著性差异(P>0.05)；但与SCO组相比,DEX组大鼠前庭核c-fos蛋白无明显差异(P>0.05),而DEX+GIN组c-fos蛋白表达显著下降(P<0.01)。2.3地塞米松联合人参皂苷对模拟晕船刺激大鼠自发活动的影响刺激露前各组大鼠在旷场内活动总路程和总时间无显著差异。而在加速度刺激后各组大鼠旷场活动总路程和总时间数与其刺激前相比,均明显减少(P<0.01),其中,SCO组大鼠自发活动量最低。DEX组和DEX+GIN组大鼠刺激后自发活动量与SAL组和SCO组比则明显增加(P<0.05,P<0.01),两组之间没有明显差别。2.4地塞米松联合人参皂苷对模拟晕船刺激大鼠体增重的影响刺激后各组大鼠的体增重幅度与其刺激前相比均有不同程度的降低,其中以DEX组大鼠体重出现明显的负增长,DEX+GIN组体增重虽比SAL组、SCO组、GIN组明显降低(P<0.01),但是比地塞米松组显著增加(P<0.01)。2.5地塞米松联合人参皂苷对模拟晕船刺激大鼠前庭核及下丘脑组胺含量的影响与SSC组相比,SSM组大鼠前庭组胺含量升高约28.5%(P<0.05),下丘脑组胺含量升高约29.1%(P<0.05)；与SSM组相比,ASM组大鼠前庭组胺含量升高约48.8%(P<0.05), ASM组大鼠下丘脑组胺含量升高约36.2%(P<0.05)；SGM组大鼠前庭组胺含量降低约24.7%(P<0.05),下丘脑组胺含量降低约34.3%(P<0.05)。2.6地塞米松联合人参皂苷对模拟晕船刺激大鼠下丘脑HDC活性的影响与SSC组相比,SSM组大鼠下丘脑组胺脱羧酶活性基本不变(P>0.05)；与SSM组相比,ASM组大鼠下丘脑组胺脱羧酶活性升高约35.3%(P<0.05)；SGM组大鼠下丘脑组胺脱羧酶活性降低约29.4%(P<0.05)。2.7地塞米松联合人参皂苷模拟晕船刺激大鼠下丘脑HDC mRNA表达的影响与SSM组相比,ASM组大鼠下丘脑组胺脱羧酶mRNA表达升高约47.1%(P<0.05)；SGM组大鼠下丘脑组胺脱羧酶：mRNA表达降低约19.1%(P<0.05)。数据的统计与处理全文实验数据采用SPSS13.0统计软件包采用Repeated Measures, one—way ANOVA,配对t检验进行数据分析,实验数据以平均数±标准差((?)±S)表示,显著性水平为P<0.05,非常显著性水平为P<0.01。结论：1.本实验条件下,模拟晕船刺激后大鼠晕反应指数变化和c-fos蛋白表达变化趋势三次实验结果一致。表明上述2个指标用于判断大鼠运动病严重程度具有较好的可重复性。自发活动作为神经系统兴奋性的判断指标,可用于抗晕船药物对中枢神经系统抑制作用严重程度的判断。三次实验中大鼠高岭土摄入量变化趋势不一致,因此将该指标用于判断大鼠运动病严重程度应该慎重。2.双侧肾上腺切除大鼠与对照组相比对模拟晕船刺激耐受力明显降低,表明缺乏糖皮质激素可增加大鼠对晕船刺激的敏感性,而外源性使用地塞米松可以显著提高模拟晕船大鼠耐受能力。但是,0.1mg/体质量地塞米松即可引起实验大鼠体重出现负增长,并呈现剂量效应关系,表明单独使用地塞米松存在副作用。3.地塞米松与人参皂苷联合甩药,具有明显提高模拟晕船大鼠耐受能力的作用,而且可以部分缓解单纯使用地塞米松所致的大鼠体重负增长幅度,并未见中枢统兴奋性抑制等副作用,提示地塞米松与人参皂苷联合用药具有较好的预防晕船作用。4.地塞米松与人参皂苷联合用药缓解晕船严重程度可能与其可以下调HDC mRNA表达,导致下丘脑内HDC活性降低,进而使前庭及下丘脑组胺含量减少有关。