论文部分内容阅读
目的：
建立小鼠角膜单纯新生血管生长、单纯新生淋巴管生长、新生血管和新生淋巴管混合生长的动物模型，以为进一步探讨角膜移植免疫排斥反应机理提供动物模型
方法：
1、缓释药物的制备
生长因子b-FGF,VEGF-A，VEGF-C购于美国R&D公司，缓释剂由中国科学院化学研究所制作，缓释载体为高分子化合物聚乙烯醇(PVA)，分别制成含药量均匀的缓释膜，在显微镜下均匀切成实验所需剂量的膜片，环氧乙烷消毒24h后置EP管中，-20℃冰箱保存备用。
2、角膜微囊袋的制作
选用48只5～8周龄BALB/c小鼠，实验分组：A组，(对照组)180ng空白载体组；B组，(单纯淋巴管生长组)25ngb-FGF组；C组，(单纯血管生长组)200ngVEGF-A组；D组，(新生血管和新生淋巴管混合生长组)180ngVEGF-C组。各组12只小鼠，均为右眼手术，在角膜中央制作2mm的囊袋，将生长因子的缓释剂植入板层囊袋中，缝合眼睑，涂抗生素眼膏。
3、大体观察
术后2天开始每天用裂隙灯观察各组小鼠角膜上皮愈合情况，角膜水肿，新生血管的生长情况以及有无并发症，并照相。并发症包括感染、前房穿通、前房出血、虹膜前粘和晶状体混浊等。
4、炎症细胞的检测，新生血管和新生淋巴管的生长和CD4+T淋巴细胞的检测
分别于术后3天，5天，7天，14天各组取3只小鼠处死并取术眼，制作冷冻切片，行常规组织病理学检查，检测炎症细胞的浸润情况；应用血管内皮细胞特异性标记CD31和淋巴管内皮细胞特异性标记LYVE-1行免疫荧光检测新生血管和新生淋巴管的生长情况，应用AdobeAcrobat7.0Professional图象分析软件分析新生血管和新生淋巴管生长面积，记录数据。同时行免疫荧光检测各组小鼠角膜CD4+T淋巴细胞的浸润情况。
结果：
大体观察：术后2天所有小鼠的角膜切口闭合，角膜上皮愈合，缓释载体溶解，角膜中央基质轻度混浊并轻度水肿。A组，术后3天可见少许新生血管从角膜缘长入，角膜中央基质较前透明，水肿减轻；5天新生血管渐消退；7天新生血管全部消退；14天角膜恢复透明，无水肿。B组，术后3天可见新生血管从周边长入角膜，大于3/4圆周，血管粗大，呈网状，角膜中央混浊，水肿；5天新生血管较前增生，呈网状全周生长；7天，新生血管未见明显生长；14天新生血管萎缩变细，角膜透明。C组，术后3天新生血管从全周长入角膜，血管浓密，呈毛刷状，角膜中央轻度混浊水肿；5天新生血管增生较前明显增加；7天新生血管轻度萎缩，角膜轻度混浊，水肿消失；14天血管萎缩变细。D组，术后3天粗大的新生血管从全周长入角膜，逐渐变得浓密，角膜中央轻度混浊水肿；5天新生血管增生较前增加；7天新生血管较前无明显增生，角膜轻度混浊，水肿消失；14天新生血管萎缩变细，角膜透明。
炎症细胞的检测：A组，术后3天可见少量炎症细胞浸润，术后5天炎症细胞减少，术后7天、14天无炎症细胞浸润。B组，C组，D组，术后3天、5天可见少量炎症细胞浸润，术后7天、14天炎症细胞逐渐消退。
新生血管和新生淋巴管的生长和CD4+T淋巴细胞的检测：A组，术后3天可见少量新生血管生长，5天，7天，14天未见新生血管生长；术后3天，5天，7天，14天均未见新生淋巴管和CD4+T淋巴细胞的阳性表达。B组，术后3天可见新生淋巴管的生长和角膜缘少量新生血管的生长(HA：8.2％±0.6％；LA：29％±1.8％);5天可见新生淋巴管的生长较前增加，而只伴有少量新生血管的生长(HA：14.1％±1.4％；LA：55％±3.2％)；7天两者的生长较前无明显变化(HA：15.1％±1.5％；LA：57％±1.4％)；14天新生血管和新生淋巴管的生长减少(HA：10％±1.5％；LA：27％±2.5％)。B组，术后5天CD4+T淋巴细胞的表达量最多，术后7天，14天逐渐减少。C组，术后3天可见新生血管的生长和仅角膜缘新生淋巴管的生长(HA：46％±2.4％；LA：12％±0.9％)；5天新生血管生长明显增多而少量新生淋巴管的生长(HA：62％±3.9％；LA：19％±2.4％)；7天两者的生长未见明显变化(HA=52％：2.5％；LA：18％±2％)；14天两者的生长明显减少(HA：38％±1.5％；LA=11％：1.5％)；术后3天，5天，7天，14天均未见CD4+T淋巴细胞的阳性表达。D组，术后3天可见少量新生血管和新生淋巴管的生长(HA：21％±2.4％;LA：18％±1.7％)，5天两者的生长均增多(HA：48％±1.5％；LA：44％±2.3％)，7天，两者的生长较前减少(HA：46％±2％；LA：38％±1.1％)，14天两者的生长明显减少(HA：18％±1.3％；LA：23％±2％)；D组，术后3天，5天，7天，14天均未见CD4+T淋巴细胞的阳性表达。
结论：
应用角膜微囊袋技术分别植入生长因子b-FGF，VEGF-A，VEGF-C的缓释剂能够建立角膜单纯新生淋巴管生长，角膜单纯新生血管生长，角膜新生血管和新生淋巴管混合生长的动物模型。该动物模型可能为进一步研究角膜移植免疫排斥反应机理提供动物模型。我们的研究也发现角膜新生血管和新生淋巴管的生长是相互依赖的。