在哺乳动物胚胎早期发育过程的研究中,造血和血管发育一直是生物学的研究热点。然而由于在胚胎循环系统在第一个造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)产生之前就已经建立,造血和血管发育的关系至今未被阐明。目前,关于造血发育起源的主要研究观点可分为两种,前者认为造血和血管内皮细胞(endothelial cell,EC)起源于共同的中胚层前体——成血管细胞(hemangioblast);后者认为造血细胞由功能特化的生血内皮(hematopoietic endothelium)分化而来。多能干细胞的分化也一直是生物学中的核心问题。Flk1(fetal liver kinase 1),血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的受体之一,也是中胚层祖细胞的标志。Flk1~+细胞代表了最早的中胚层细胞之一,具有能向多种中胚层谱系的分化潜能,最早因具有造血和血管内皮谱系双向分化潜能为人所知。研究表明,所有成体造血谱系都经历了Flk1的表达阶段,可见Flk1与造血与血管谱系的发育密切相关。Toshiyuki Motoike等人利用遗传谱系示踪系统证明Flk1~+祖细胞还具有向肌肉谱系分化的命运。此外,Gorden Keller等人还鉴定了Flk1~+细胞具有向心血管谱系分化的潜能。近期,利用成年小鼠的乳腺脂肪垫为研究模型,提供了Procr~+内皮细胞在成年小鼠体内能够分化为新生周细胞的直接证据。我们认为在哺乳动物早期胚胎发育过程中,Flk1~+祖细胞可能还有更广泛的分化潜能。在本研究中,为了解这群中胚层来源的具有多系分化潜能的Flk1~+祖细胞在小鼠胚胎发育早期不同部位的谱系分化情况,以及探索Flk1~+祖细胞是否在血管发育过程中还有分化为周细胞等间质谱系的潜能,基于Cre-LoxP系统的条件型基因敲除研究策略,利用Flk1-Cre小鼠和ROSA26报告小鼠进行谱系示踪研究。在报告小鼠中,用YFP~+群体示踪Flk1~+祖细胞群体的命运。此外,结合中胚层标志Flk1,造血细胞特异性标志CD45,内皮细胞特异性标志CD31、CD144以及Emcn(endomucin),周细胞特异性标志PDGFRβ和NG2,利用免疫组化、免疫荧光等组织学的研究方法和流式分析来解决关注的问题。在第一部分的研究中,对谱系示踪小鼠Flk1-Cre;ROSA26-EYFP在胚胎发育早期E8.5-10.5的不同部位的免疫组化结果显示,例如背主动脉(dorsal aorta,DA)、肢芽(limb buds)及卵黄囊(yolk sac,YS)等多处的YFP~+群体中,观察到血细胞、沿着血管壁特异性分布的CD31~+Emcn~+典型内皮细胞以及非内皮形态的间质样细胞等多种类型的细胞。提示Flk1~+群体除了造血、血管内皮、以及肌肉谱系的分化潜能外,可能还有更广泛的潜能。在第二部分的研究中,结合内皮表面特异性标志对谱系示踪小鼠Flk1-Cre;ROSA26-EYFP胚胎进行免疫荧光双标,结果证实在背主动脉(dorsal aorta)、胎肝(fetal liver)等多处造血位点的YFP~+群体中的确存在CD31~-间质样细胞。最后,结合内皮和周细胞标记的免疫荧光三标结果显示,这群表达在血管周围的既非造血又非内皮的细胞是PDGFRβ~+NG2~+周细胞。流式细胞分析结果也证实,Flk1~+祖细胞不仅贡献了造血谱系、血管内皮谱系,也贡献了这群周细胞。这些研究结果提示我们Flk1~+祖细胞来源的YFP~+群体除了贡献造血、内皮、肌肉、心血管等谱系外,还有向周细胞的分化潜能。有趣的是,在Flk1-Cre;ROSA26-EYFP胚胎发育早期E10.5的不同部位,如背主动脉、肢芽等,我们观察到YFP~+群体中出现了小部分表现为间质样形态,内皮标志CD31和间质标志CD140b都表现为阳性的细胞群体。研究表明,在正常生理过程和病理条件下,都已观察到内皮细胞的内皮间质转化(endothelial–mesenchymal transition,EndMT)作用,证明内皮细胞的分化潜能及其在体内外环境中的可塑性。由此推测,CD31~+CD140b~+群体可能是Flk1~+祖细胞分化而来的内皮细胞正在经历着EndMT而逐渐丢失其内皮表面的特异性标记,同时也开始表达间质细胞或周细胞表面标志分子。这个内皮和间质标记表现为双阳性的群体究竟是不是在免疫组织学中观察到的周细胞,是否确实由Flk1~+祖细胞来源的内皮在经历了EndMT后表现干细胞特性后分化而来,还有待进一步研究。