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机理I型植物在吸收和利用铁时,需将Fe<3+>还原为Fe<2+>,在此过程中Fe3’.还原酶起到了关键作用。苹果属小金海棠(Malus xiaojinensis Cheng et.Jiang)是机理Ⅰ型植物,也是铁高效基因型植物。为了研究其抗缺铁的分子生物学机理,从小金海棠中克隆:Fe<3+>-还原酶基因MxFRO2,分析了该基因的表达情况,并在酵母中初步研究该基因的功能。结果如下:
(1)根据Fe<3+>-还原酶基因家族的功能保守区序列设计简并引物,利用RT-PCR及RACE等方法克隆了小金海棠Fe<3+>-还原酶基因MxFRO2。MxFRO2的cDNA序列全长2417bp,开放阅读框为2166bp,编码722个氨基酸,分子量约为81kDa。小金海棠MxFRO2与豌豆PsFRO及番茄LeFRO蛋白具有77%的同源性,与拟南芥AtFRO2蛋白具有74%的同源性,与AtFRO1具有71%的同源性。跨膜结构分析发现该蛋白具有9个跨膜结构域,有FAD结合位点和NADPH结合位点以及2对与血红素结合的His残基。
(2)半定量RT-PCR结果表明,正常供铁时,在小金海棠的根和叶中均没有检测到MxFRO2基因的表达;当缺铁处理2天时,.MxFRO2基因有了微弱的表达;此后随着缺铁处理时间的延长,基因的表达逐渐增强。说明小金海棠MxFRO2基因在根及叶片中均受缺铁胁迫诱导而加强表达。
(3)将MxFRO2转入到野生型酵母中,结果表明转基因酵母的Fe<3+>-还原酶活性得到了显著提高,是对照的2.8倍,因此我们初步推测MxFRO2基因编码的蛋白具有Fe<3+>-还原酶活性。