背景及目的P190蛋白是一种神经元跨膜蛋白,由1384个氨基酸组成。最初发现于有髓神经纤维郎飞氏节的节旁侧,主要在脊椎动物脑内表达,另外在卵巢、胰脏、肠、肺、心脏及睾丸等组织内也有少量表达。P190蛋白与髓鞘蛋白NF155等结合,在神经轴突的节旁侧形成节旁连接(Paranodal junction),这种连接结构类似于间隔连接(Septate junction)。间隔连接广泛存在于果蝇等无脊椎动物的血-神经屏障处,与脊椎动物血脑屏障处的紧密连接功能类似。目前研究表明,脊椎动物内由P190、NF155等蛋白形成的节旁连接在维持神经冲动的跳跃式传导、轴突1胶质细胞间信息快速传递、轴突特化区域的形成及轴-胶间隙与细胞外基质间屏障形成中发挥重要作用。P190蛋白表达异常可产生严重的神经系统功能紊乱,P190-／-型小鼠的神经冲动传导速度明显低于正常小鼠,而且在出生后不久即因神经元变性坏死而导致死亡。另外有研究显示多发性硬化症(Multiple Sclerosis, MS)患者脑内P190表达水平明显降低。P190表达降低可进一步导致髓鞘脱离轴突,促进轴突变性坏死,进而形成神经元变性损伤的恶性循环。在糖尿病性神经病变的大鼠中,P190的表达水平也明显降低。由此可见,P190蛋白的功能是至关重要的,但其具体功能和作用机制还不清楚。血脑屏障(blood-brain barrier, BBB)是由脑微血管内皮细胞、星型胶质细胞、基膜及周细胞等共同组成的高度特化的神经血管结构单元。其中脑微血管内皮细胞间的紧密连接和粘附连接是构成血脑屏障结构的基础,也是维持血脑屏障功能的关键。目前已知的内皮细胞间连接相关蛋白已有很多,包括跨膜蛋白和细胞内的衔接蛋白；同时对内皮细胞间紧密连接和粘附连接的作用机制也有了深入认识,但仍有待发现更多的连接蛋白及更深入的了解内皮细胞屏障功能机制。我室研究人员发现P190蛋白除了在神经轴突有表达外,在人脑微血管内皮细胞(Human brain microvascular endothelial cell, HBMEC)内也有大量表达,而且表达的P190蛋白在细胞间连接处有聚集的倾向。基于此,本研究通过构建P190蛋白的一系列突变体作为基础,进一步检测P190显性缺失突变对HBMEC功能的影响；同时利用酵母双杂交的方法,筛选与P190蛋白的胞内段互作的蛋白,期望找出P190对内皮细胞功能作用的机制。方法1、根据已有的P190全长基因序列,利用重叠PCR的方法获得P190不同结构域缺失的基因序列,克隆至真核细胞表达载体pcDNA3.1/myc-His B上,并稳定转染至第26代人脑微血管内皮细胞(HBMEC)中,Western blot法验证阳性细胞株。2、体外血管形成实验检测P190不同结构域缺失突变对HBMEC形成血管的能力是否有影响。3、悬滴聚集实验(Hanging-drop aggregation assay)检测P190不同结构域缺失突变对HBMEC的细胞间黏附力是否有影响。4、用HRP通透性实验,检测P190不同结构域缺失突变对HBMEC形成的细胞单层的通透性是否有影响。5、利用蛋白质免疫印迹的方法检测P190不同结构域缺失突变对HBMEC的紧密连接相关蛋白ZO-1和黏附连接蛋白VE-cadherin的表达是否有影响。6、利用细胞免疫荧光方法检测P190不同结构域缺失突变对HBMEC胞间连接结构及对ZO-1和VE-cadherin的分布是否有影响。7、利用酵母双杂交实验筛选人胎脑文库中与P190胞内段互作的蛋白,并用GST-pull down法进行验证。结果1、成功获得P190不同结构域缺失的基因序列,经测序验证后,成功转染至人脑微血管内皮细胞,获得相应的细胞株。2、体外血管形成实验结果显示,P190不同结构域缺失突变对HBMEC的血管形成能力无影响。3、悬滴聚集实验表明,P190胞内段缺失突变的内皮细胞其细胞间黏附力明显低于对照组细胞。4、HRP通透性实验表明,P190胞内段缺失型内皮细胞对HRP的通透性明显高于对照组细胞,且有统计学意义；而SH3或band4.1结构域分别缺失的内皮细胞与对照组细胞相比,通透性无明显变化。5、Western blot结果显示,细胞连接蛋白ZO-1和VE-cadherin在各种突变型细胞和对照组细胞内,表达水平趋于一致。6、免疫荧光实验结果显示,对照组细胞和SH3、band4.1结构域缺失的内皮细胞的细胞间连接结构较完整,紧密连接蛋白ZO-1和黏附连接蛋白VE-cadherin在细胞间连接处呈连续的线状分布；而P190胞内段全部缺失的内皮细胞,细胞间连接结构破裂不完整,而且ZO-1和VE-cadherin在细胞间连接处呈点状或交错的刺状分布。7、酵母双杂交法筛选得到14个阳性克隆,根据文献资料选择ATP1B3进行验证。结论人脑微血管内皮细胞中P190蛋白胞内段(1305-1384aa)缺失后,可使内皮细胞单层的通透性明显提高,同时人脑微血管内皮细胞间的黏附能力降低,进而破坏血脑屏障的完整性。但这种作用的具体机制及P190是否直接参与人脑微血管内皮细胞间的连接还有待进一步研究。