目的1、观察固本增骨胶囊含药血清对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化的效应,并检测相关蛋白的表达,初步探讨含药血清对BMSCs的影响。2、检测Wnt/β-catenin信号通路相关基因的表达,探讨固本增骨胶囊含药血清基于Wnt/β-catenin信号通路治疗骨质疏松症的作用机制,为固本增骨胶囊治疗OP作用靶点提供实验依据。方法1、制备固本增骨胶囊含药血清;设置对照试验,MTT法测量不同浓度含药血清培养下的大鼠BMSCs细胞增殖率;茜素红染色观察矿化程度;Western-blot技术检测Ⅰ型胶原蛋白(collagen-Ⅰ)、骨特异性转录因子(Runx2)、骨钙素(BGP)的表达,探讨不同浓度固本增骨胶囊含药血清对大鼠BMSCs成骨分化的影响。2、Real-time PCR技术检测Wnt/β-catenin信号通路相关基因LRP-5、β-catenin、LEF-1、Runx2 mRNA的表达,探讨固本增骨胶囊含药血清基于Wnt/β-catenin信号通路治疗骨质疏松症的作用机制;通过上述实验研究为固本增骨胶囊临床治疗OP提供理论依据。结果1、Wistar大鼠BMSCs的传代培养:P1代Wistar大鼠BMSCs复苏后,可见细胞呈短梭形贴壁生长,培养5天后细胞逐渐呈分散集落状态生长并形成小的克隆;传代培养12小时后,细胞贴壁生长;培养24小时后,镜下见细胞呈针尖样梭形,均匀分布;培养4~5天后细胞融合度达80%以上,并成群排列顺向生长。2、MTT法测量细胞增值率:不同时点组间OD值比较差异均具有统计学意义(P<0.05),从时点维度看,72h、96h、120h OD值均与24h与48h OD值差异具有统计学意义(P<0.05),且前者均高于后者;从干预措施维度看,10%、20%、30%含药血清组OD值与其余组别比较差异均具有统计学意义(P<0.05),前者OD值均高于后者,且以20%含药血清组为最高,其余组别间OD值比较差异均无统计学意义(P>0.05),其余组间均具有统计学意义(P<0.05),提示20%含药血清组效果最佳,且作用96小时后,细胞增殖作用最强。3、茜素红染色观察:细胞成骨诱导培养28天后镜下可见含药血清组(5%、10%、20%)随着浓度增加,红色钙结节数量也逐渐增加,尤其浓度在20%时,红色钙结节数量最为显著,当浓度继续增加到30%时,钙结节数量呈下降趋势。4、成骨相关蛋白检测:Western Blot结果显示,含药血清组浓度在5%、10%、20%时,collagen-Ⅰ、BGP、Runx2蛋白的表达随着浓度增加呈正相关,尤其浓度为20%时,蛋白表达水平呈现峰值,且明显高于空白组与传统诱导组,差异具有显著统计学意义(P<0.05);当含药血清浓度继续增加到30%时,成骨相关蛋白的表达成下降趋势。5、成骨相关基因检测:Real-time PCR结果显示,含药血清组浓度在5%、10%、20%时,随着浓度的增加,Wnt/β-catenin信号通路LRP-5、β-catenin、LEF-1、Runx2 mRNA的表达呈明显增长趋势,其中20%含药血清效果最佳,mRNA表达最高,与其他各组比较均具有统计学意义(P<0.05);当血清浓度继续增加到30%时,mRNA的表达成下降趋势。结论1、固本增骨胶囊含药血清能明显促进大鼠BMSCs的成骨分化与矿化能力,促进钙结节的形成;且以浓度为20%的含药血清作用效果最佳,96小时后细胞增殖作用最强。2、固本增骨胶囊含药血清能够促进成骨相关蛋白collagen-Ⅰ、BGP、Runx2的表达,明显上调Wnt/β-catenin信号通路LRP-5、β-catenin、LEF-1、Runx2 mRNA的表达,最终促进骨形成。