第一部分以柠檬酸作为交联剂构建壳聚糖/柠檬酸水凝胶目的:脊髓损伤是一项困扰世界多年的医学难题,至今仍无令人满意的治疗方式。神经支架可以改善脊髓损伤部位微环境,同时可以为新生轴突提供物理指引,是一种非常具有潜力的治疗方式,引起学者们的强烈关注。壳聚糖是一种天然蛋白多糖,具有组织相容性好,可降解等优势,是一种性能优异的生物材料,但它的理化性能限制了它的应用。有鉴于此,我们引入柠檬酸作为交联剂,希望以此增强壳聚糖水凝胶的强度,进而可以用于构建神经修复支架。方法:3wt%壳聚糖溶液分别与0.3wt%,0.33wt%和0.38wt%柠檬酸溶液发生反应,采用冷冻干燥法反复冻融,最终形成不同比例的壳聚糖/柠檬酸水凝胶。将不同比例的壳聚糖/柠檬酸溶液加入特制模具中形成神经损伤修复支架供动物学实验使用。使用傅立叶变换红外光谱分析法检测样本了解壳聚糖/柠檬酸的化学结构和分子相互作用。使用扫描电子显微镜分析法检测样品结构和表征。结果:3wt%壳聚糖溶液分别与0.3wt%,0.33wt%和0.38wt%柠檬酸溶液通过冷冻干燥法可形成水凝胶,凝胶结构完整,呈淡黄色半透明状,有足够的弹性维持外形。通过傅立叶变换红外光谱分析发现,壳聚糖中的氨基与柠檬酸中的羧基发生了酰化反应。通过反应,向壳聚糖分子中引入了羧基这一亲水性基团,进而促使壳聚糖中的氨基转化为酰胺键。由电子扫描电镜可以看到各种比例柠檬酸/壳聚糖水凝胶都具有良好的疏松多孔结构,随着柠檬酸含量的增加,壳聚糖-柠檬酸分子颗粒更小,排列更加平滑紧密,孔隙也更加规律。结论:壳聚糖/柠檬酸水凝胶及神经支架合成成功。壳聚糖中的氨基与柠檬酸中的羧基发生了酰化反应,形成了疏松多孔结构的水凝胶物质。第二部分不同配比壳聚糖/柠檬酸水凝胶的生物相容性和生物学活性研究目的:将新生大鼠神经元原代细胞及小鼠成神经细胞瘤细胞系(Neuro-2a细胞)与壳聚糖/柠檬酸水凝胶进行共培养,研究壳聚糖/柠檬酸水凝胶对神经细胞活性、黏附和轴突生长的作用。方法:将新生大鼠神经元原代细胞或Neuro-2a细胞,分别和不同配比的壳聚糖/柠檬酸水凝胶进行共培养,设立空白对照组、单纯壳聚糖水凝胶对照组,通过细胞核DAPI染色,在显微镜下计数细胞以检测水凝胶的毒性。同时应用CCK-8实验,检测Neuro-2a细胞在不同水凝胶中培养24小时、48小时及72小时后的增殖变化情况。此外,将Neuro-2a细胞在不同水凝胶中培养72小时后,通过RT-qPCR实验对其进行Bcl2、Bax、SOD、caspase-3的表达量检测,了解水凝胶在细胞凋亡过程中的作用情况。最后,使用鬼笔环肽染色,结合荧光显微镜观察Neuro-2a细胞轴突比例和长度,了解不同水凝胶的生物活性。结果:将新生大鼠神经元原代细胞或Neuro-2a细胞分别与壳聚糖/柠檬酸水凝胶共培养,以与单纯壳聚糖水凝胶共培养作为对照,结果显示壳聚糖/柠檬酸水凝胶培养条件下细胞计数更高,生物相容性也更好。通过CCK-8实验发现,壳聚糖/柠檬酸水凝胶各组与单纯壳聚糖组相比,具有明显促进细胞增殖的作用。此外,壳聚糖/柠檬酸水凝胶不会诱导细胞凋亡,未对神经细胞产生损伤作用。并且,壳聚糖/柠檬酸水凝胶可促进Neuro-2a细胞神经突起的显著生长。其中,3wt%壳聚糖溶液与0.33wt%柠檬酸溶液构成的水凝胶的作用最为显著。结论:壳聚糖/柠檬酸水凝胶具有良好的生物相容性,对神经细胞无明显毒性,同时可以促进神经细胞轴突生长。结合生物相容性和生物活性角度考虑,3wt%壳聚糖溶液与0.33wt%柠檬酸溶液构成的水凝胶具有最大的应用潜力。第三部分不同配比壳聚糖/柠檬酸神经支架修复大鼠脊髓横断损伤的在体研究目的:建立大鼠胸段脊髓横断模型,将不同配比壳聚糖//柠檬酸水凝胶神经修复支架植入脊髓损伤部位,观察不同配比壳聚糖//柠檬酸水凝胶神经修复支架对脊髓损伤的修复效果。方法:麻醉大鼠后,行椎板切除术暴露脊髓,于胸9-胸10节段完全横断,形成约2毫米长脊髓完全缺损,建立大鼠脊髓完全横断模型。设立假手术组,对照组,支架组。其中支架组进一步根据神经修复支架种类分为CH8/CA1组,CH9/CA1组和CH10/CA1组(各9只)。术后每周称量大鼠体重,并采用Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)运动功能评分系统对大鼠运动功能进行测定评分。于术后2周,4周,12周三个时间点分批分组处死大鼠,并进行组织检测,包括HE染色,Masson染色,LBF染色及免疫荧光染色(NF-H,GFAP)。最终统计各项染色情况。结果:大鼠脊髓完全横断模型建立成功,各组大鼠术后第一日双侧后肢完全瘫痪,排尿功能丧失。术后各组大鼠BBB评分均有所升高,但支架组大鼠运动功能的恢复情况较对照组显著(p