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目的：
利用微弧氧化技术,在纯钛表面制备不同锌含量的钙磷活性涂层。以不加锌组作为对照组,比较纯钛表面三种不同锌含量的活性涂层在的理化性能及其对成骨细胞(MG63)生物学特性的影响。
方法：
在微弧氧化的电解液中加入相同浓度的钙、磷和三种不同浓度的锌来处理纯钛片,制成低、中、高三种不同锌含量的钙磷活性涂层,分别计为低锌组、中锌组和高锌组,不加锌组作为对照组。利用电子万能测试机检测涂层与钛基底的结合力,扫描电镜(SEM)观察钛片表面形貌,X线衍射(XRD)分析材料表面晶相结构,X射线光电子能谱仪(XPS)分析材料表面化学组成及元素成分,模拟体液浸泡后XPS分析材料表面元素变化,浸提液测试溶液中离子变化;材料表面培养MG63细胞后进行扫描电镜(SEM)观察,四甲基偶氮唑盐法(MTT)检测,碱性磷酸酶(AKP)活性、总蛋白含量及骨钙素(OC)的分泌测定。分别评价成骨细胞在四种材料表面黏附、增殖和分化的水平。所得数据经SPSS17.0处理,进行单因素方差分析。
结果：
一、材料理化性能分析
膜基结合力测试:通过微弧氧化的处理,四组不同锌含量的磷涂层与钛基底的结合力相当,分别为对照组:29.8MPa、低锌组:30.7MPa、中锌组:30.2MPa、高锌组:31.3MPa。
钛片表面形貌:通过SEM观察,对照组和低锌组的氧化膜呈微孔状结构,表面致密均匀,孔隙外周凸起;中锌组出现少量孔洞样结构;而高锌组氧化膜呈现出大量蜂窝状结构,表面粗糙多孔,孔隙似火山口状,大小不一。四组材料孔径及粗糙度随锌含量提高而逐渐增加。
材料表面晶相结构:通过XRD分析,四组晶相结构相似,在25°和48.2°附近均出现锐钛矿结构,在40°时发现板钛矿结构,低锌组结晶优于高锌组,未发现锌和钙的结晶峰。
材料表面元素成分及化学组成:通过XPS分析,随着电解液中锌浓度的提高,涂层中锌所占比重随之增加,钙和钛所占比重随之减少。四组中钙元素主要以Ca0和HA存在,随着锌含量的增加,CaO含量增加,HA含量减少。锌影响HA晶格的形成。三组实验组锌元素主要是以Zn3P2和ZnO存在,低锌和中锌组Zn3P2和ZnO的含量较为相似,高锌组Zn3P2减少ZnO增多。
模拟体液浸泡后材料表面元素比重变化:通过XPS分析,三组实验组涂层中的锌含量均随时间的延长而降低。钙、磷元素在低锌组中增加最为明显,而高锌组递减。钛元素比重在高锌组中增加,其他三组减少。
浸提液离子浓度变化:通过浸提液离子析出测试,随着浸泡时间的延长,钙离子在低锌、中锌和对照组中逐渐减少,在高锌组中略有增加:在12d和24d的检测中,钙离子浓度由高到低排序为:高锌组＞对照组＞中锌组＞低锌组:锌离子析出的浓度过低,各组各时间点均小于1mg/L。
二、生物学性能分析
成骨细胞在材料表面的形貌:通过SEM观察,细胞培养6h时,低锌组细胞已完全黏附,表面凸起,伸出伪足,有矿物质沉积在表面;对照组和中锌组细胞则刚黏附于膜层表面,呈半透明状,看不见伪足和细胞凸起;而高锌组看不见任何细胞形态。细胞培养24h时,低锌组细胞伪足完全伸展,伸入微孔内部,表面矿物质沉积增多;对照组和中锌组细胞凸起,伪足伸展,但中锌组伪足伸展不如对照组充分;而高锌组只能隐约观察到半透明状膜样结构。细胞培养48h时,对照组、低锌组和中锌组均可见细胞分裂增殖,而高锌组仍然看不见明显的细胞形态,氧化膜被多个类似细胞形状的膜分割,其内部微孔比周围小。
细胞增殖情况:培养1、3、5、7d后,通过MTT检测,四组材料表面的MG63细胞数量均随培养时间的延长而增多,在各个时间点,四组增殖情况由高到低排序均为:低锌组＞中锌组＞对照组＞高锌组,且各组之间差异均存在统计学意义(P＜0.05)。
碱性磷酸酶及总蛋白含量:通过AKP及总蛋白含量检测,细胞培养3、5、10d时,碱性磷酸酶活性和总蛋白含量均随培养时间的延长而提高,其含量的高低顺序为:低锌组＞中锌组＞对照组＞高锌组,各组之间差异均有统计学意义(P＜0.05)。培养到第15d时,各组表达均有所下降,但高低顺序仍未改变,各组之间差异仍具有统计学意义(P＜0.05)。
骨钙素分泌情况:通过0C含量检测,细胞培养8、12、16d后,各组骨钙素表达随时间延长而提高,第16d最为明显。表达情况的高低顺序仍为低锌组＞中锌组＞对照组＞高锌组,各组之间差异具有统计学意义(P＜0.05)。
结论：
1.通过对四组材料表面涂层的理化性能分析,发现随着锌含量的提高,涂层的孔径及粗糙度随之增加;低锌组结晶优于高锌组;低锌组HA和Zn3P2含量较多,高锌组ZnO含量多;低锌组在模拟体液浸泡后材料表面钙、磷和锌比重增加最为明显,而浸提液中钙离子浓度减少最显著。
2.通过生物学性能的分析,证实了低含量的钙磷涂层的生物活性明显优于其他三组,促进了成骨细胞的黏附、增殖和分化,生物相容性最佳,而高含量的锌抑制成骨细胞的生长。