肺癌是目前最常见的恶性肿瘤，在全球范围内严重危害着人类的健康。尽管手术技术和其他传统的治疗方法，如化疗和放射治疗在不断取得重大进展，但大多数肺癌患者的预后依然面临着巨大威胁。因此，了解肺癌发生过程中的分子机制对于开展更有效的诊疗手段显得极为重要。基因组不稳定性被认为是肿瘤细胞的特异性标志，在肿瘤发生过程中具有重要作用。而最近在酵母细胞的研究中发现的Cohesin复合体因其与肿瘤细胞基因组不稳定性密切相关，目前受到了学界广泛关注。人们希望通过研究这一多功能的蛋白复合体，从而进一步了解肿瘤发生发展过程中的分子机制。从酵母细胞到人类的体细胞，Cohesin复合体在进化过程中呈高度保守，其构成包括：一对SMC（结构维持染色体）蛋白，即SMC1A的、SMC3，和两个非SMC蛋白质，RAD21/SCC1和STAG/SCC3/SA等四个亚基。SMC1A和SMC3组成两个螺旋域，并通过它们的铰链域（hinge domain），形成反向平行的异二聚体。他们的头域（head domain）则分别与RAD21相互作用，创建一个环状结构。通过该环状结构Cohesin复合体不仅可以捕获DNA，调控姐妹染色单体在S期的复制，而且在分裂后期姊妹染色体分离时，可以确保其精确分离，从而维护基因组稳定性。目前已有多项实验研究证实Cohesin复合体在DNA修复，细胞周期调控，基因转录调控和基因组印记等细胞生物活动中扮演着重要角色。近年来人们在多项研究中发现SMC1A与CIN和肿瘤发生密切相关，其主要部件及相关基因的表达异常在多种人类肿瘤细胞中被发现。然而迄今为止，尚未有文献报道SMC1A基因在人类肺癌发生发展过程中的功能作用。RNA干扰技术，作为功能基因组学强有力的工具，为我们探索肿瘤相关基因提供了新的方法。在本研究中，我们通过构建含特异性下调SMC1A基因表达的小分子干扰RNA（siRNA）的慢病毒载体，有效地抑制了SMC1A在人肺腺癌A549和H1299细胞的表达，并在体外水平探究SMC1A沉默对肺癌细胞生长和侵袭能力的影响。此外，我们通过流式细胞技术检测了SMC1A的表达下调对肿瘤细胞细胞周期分布及凋亡的影响。方法1shSMC1A-pFH1UGW重组质粒的构建及慢病毒包装搜索GeneBank中SMC1A的已知mRNA序列（NCBI Reference Sequence:NM₀06306.2），针对该序列设计一对正反向oligo，其正向序列为5’-TAGGAGGTTCTTCTGAGTACA-3’；在Annealing Buffer中退火，是其形成双链结构。选用适宜的多克隆位点，应用双酶切体系以进行质粒酶切。T4Ligase进行供体和载体的定向连接，并将连接产物转化于HB101感受态细胞内，隔日进行Amp抗性筛选。经PCR鉴定后挑取阳性克隆进行测序。构建阴性对照组的重组质粒同理。2慢病毒包装及细胞转染应用Lipofectamine2000（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）,将重组质粒PFH1UGW-shSMC1A和阴性对照组PFH1UGW-shCon与另外两个质粒：Packaging plasmd: pCMV⊿R8.92（containing gag/pol without packaging signal andshortened LTRs）和Envelop protein containing plasmid: pVSVG （env）共转染于293T细胞，72h后将含有Lv-shSMC1A和Lv-shCon病毒颗粒的细胞悬液收集,感染肺腺癌A549和H1299细胞，MOI值为30。未转染的细胞设为空白对照组。荧光显微镜观察病毒的转染效率并用qPCR和Western Blotting技术检测A549和H1299细胞内SMC1A的基础表达量，在mRNA和蛋白水平验证SMC1A基因敲减效率。3细胞生长抑制试验-MTT法在转染病毒72小时后，将A549及H1299细胞培养于含10%FBS的DMEM培养基中，37℃，5%CO2培养，隔日换液，0.25%胰蛋白酶消化传代。待细胞长至80%融合时，胰酶消化，PBS洗两次，无血清培养基调制A549细胞浓度为2×10⁴/ml接种于96孔平板，每孔100μl（2000个/孔）;调制H1299细胞浓度为6×10⁵/ml接种于96孔平板，每孔100μl（6×10⁴个/孔）。将其分为3组，即空白对照组，病毒阴性对照组及实验组。随即在24,48,72,96及120h的时间点加入滤过的10μl MTT工作液（5mg/ml），37℃孵育4h，加入100μlDMSO溶液终止反应。在595nm处检测吸收峰值并进行统计分析。4克隆形成实验检测肿瘤细胞克隆形成能力细胞培养同上。待细胞长至80%融合时，消化细胞，制成细胞悬液，进行细胞计数。将A549细胞（200个细胞/孔）及H1299（50000个/孔）细胞接种于于六孔培养板，每组设3个复孔。将接种好的细胞于培养箱中继续培养8天，中途隔3天进行换液并观察细胞状态。克隆形成后，于荧光显微镜下对细胞克隆进行拍照。吸去培养皿内溶液，用PBS洗两次后加入4%多聚甲醛700μl/孔，放置在4℃冰箱固定细胞60分钟。吸去固定液，用PBS洗两次后加入洁净、无杂质的GIEMSA染液500uL染细胞，摇床上震荡20分钟。吸去GIEMSA染液于回收50ml离心管中，孔板竖直缓慢放入自来水中，避免产生激流冲掉细胞，浸没于水中，逆该过程取出孔板，如此数次，直至洗净板上背景，晾干。5肿瘤细胞迁移试验（Transwell小室试验）细胞培养同上。待细胞长至80%融合时，消化细胞，制成细胞悬液，进行细胞计数。用含0.1%BSA的无血清培养基重悬细胞。调整细胞密度至A549细胞30000个/孔；H1299细胞80000个/孔。建立迁移模型：a)于一24孔板中加入500μL含20%FBS的培养基；小室内部加入200μl细胞悬液；用镊子将小室小心转移至含有培养基的24孔板孔中，避免出现气泡；在细胞培养箱中培养24小时。吸去上室内培养基，用PBS或培养液湿润棉签，用棉签轻轻擦去上室内的细胞，10％甲醇溶液固定细胞，0.1%结晶紫染色，自来水中清洗至背景清晰。镜下随机选取5个视野，计数过膜细胞数。33%醋酸脱色将结晶紫完全洗脱下来，酶标仪570nm处测其OD值，间接反映细胞数。6PI染色检测细胞周期及凋亡配制PI染色液（所有试剂置于冰上配制）。细胞培养同上。待细胞长至80%融合时，消化细胞，制成细胞悬液，进行细胞计数。150000个/孔A549及200000个/孔H1299细胞铺板，培养48小时，收集培养上清于15mL离心管中，用胰酶消化贴壁细胞收集于同一离心管中，离心1500rpm×5min；用1mL预冷的PBS洗涤细胞一次，转移细胞至1.5mL离心管，4°C离心1500rpm×5min收集细胞；另取一1.5mL离心管，加入预冷的75%乙醇950μL；用50μL预冷PBS重悬细胞，并吹散成单细胞悬液；将单细胞悬液逐滴加入预冷的75%乙醇950μL中，于涡旋振荡器中混匀，细胞置于4°C，固定24小时，染色。结果及讨论（1）SMC1A在肺腺癌细胞A549及H1299细胞的基础表达及慢病毒感染效率的验证qPCR和Western Blottingting实验表明SMC1A在H1299细胞内的表达量较高。慢病毒转染滴度（MOI）为30（2）实时定量PCR结果表明在Lv-shSMC1A感染的肿瘤细胞内SMC1A基因在mRNA的表达水平显著低于空白对照（Con组）和阴性对照组（shCon）感染的细胞。此外，Western Blottingting检测进一步表明，实验组的肿瘤细胞SMC1A蛋白表达水平显著下降。因此，这些结果表明慢病毒介的RNAi可以有效抑制肿瘤细胞内SMC1A基因的表达。（3）为了探究SMC1A基因沉默对肺癌细胞增殖的影响，我们采用MTT实验检测Lv-shSMC1A感染后的细胞增殖情况。MTT检测结果显示，在感染120小时后，Lv-shCon病毒感染的细胞与未感染的细胞相比，增殖并没有显著差异，表现出较强的增殖能力，而Lv-shSMC1A感染的细胞其增殖显著变慢。（4）克隆形成实验表明，孵育8天之后，Lv-shSMC1A感染的肿瘤细胞的克隆形成能力显著低于空白对照和Lv-shCon感染的细胞（P <0.01）。因此，其形成的克隆大小也明显变小。这些结果表明Lv-shSMC1A感染的A549和H1299细胞的SMC1A表达的下调抑制肿瘤细胞克隆形成能力。（5） Transwell小室实验表明Lv-shCon感染的细胞的侵袭能力与未感染的细胞细胞相比无明显差异，并表现出较强的侵袭能力。然而，Lv-shSMC1A感染的肿瘤细胞的侵袭能力和LV-shCon感染的细胞及未感染的细胞相比显着降低。这表明SMC1A表达的下调可以抑制肺癌细胞的侵袭力。（6）通过FACS流式细胞仪检测细胞在细胞周期的分布情况，我们发现在G1和S期的Lv-shCon感染的细胞与未感染的细胞相比，其分布并没有明显差异。而Lv-shSMC1A感染的细胞G1期的分布显著增高。相比之下，在S期，Lv-shSMC1A感染的细胞的分布减少（P <0.01）。这些结果表明，在A549和H1299细胞，SMC1A表达的下调导致细胞周期阻滞于G1/S过渡期此外，Lv-shCon感染的细胞在亚G1期的分布与未感染的细胞之间没有出现显著性差异，而Lv-shSMC1A感染的细胞表现出明显的sub-G1凋亡峰。该结果提示，SMC1A表达的下调可能会触发在肺癌细胞的凋亡，从而抑制肿瘤细胞的生长。由于目前肺癌已被确立为一种高度异质性的疾病，其基因表达框架的改变往往呈多样性。因此深入了解肿瘤发生发展的分子机制，无疑对我们寻找最佳治疗方法具有重要意义。此外，目前有大量证据表明，对其分子机制深入研究可以促进开发出特异性杀伤恶性细胞的靶向治疗药物。Cohesin分子是一种最近才被发现的蛋白复合体，但因其控调节基因组的稳定性并被证明与多种人类癌症高度相关引起了学界广泛的关注。在本研究中，我们采用了目前广泛普及的慢病毒载体介导的RNAi技术体系，探究SMC1A的沉默对肿瘤细胞生长和侵袭的影响。通过三质粒系统构建特异性沉默SMC1A的慢病毒，感染A549和H1299细胞，研究SMC1A的表达下调在体外水平对肿瘤细胞的影响。我们发现SMC1A表达的下调，极大地减弱了A549和H1299细胞的增殖和集落形成能力。此外，我们通过Transwell小室侵袭实验证明SMC1A沉默可以显著降低肺癌细胞的迁移能力。此外我们观察到SMC1A的表达下调可以介导细胞周期停滞在G1/S期。此外，SMC1A沉默可触发细胞凋亡。这些研究结果均首次报告SMC1A参与调控肺癌细胞的恶性行为，在国内、国外均未见报道。