【摘 要】
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细菌感染引起越来越多的医疗和公众关注。随着人类预期寿命的不断延长,易受细菌感染的人数也在增加。更复杂的是,目前的抗微生物疗法面临着无处不在的耐药微生物(如耐氧西林金黄色葡萄球菌)的挑战。耐药菌引发的感染发生频率高,且难以诊断和治疗。目前,传统的细菌检测方法,如培养基培养技术、酶联免疫吸附试验(ELISA)和聚合酶链反应(PCR)分析等耗时长,而且缺乏足够的分辨率和实用性,不能明确区分细菌感染,更不
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细菌感染引起越来越多的医疗和公众关注。随着人类预期寿命的不断延长,易受细菌感染的人数也在增加。更复杂的是,目前的抗微生物疗法面临着无处不在的耐药微生物(如耐氧西林金黄色葡萄球菌)的挑战。耐药菌引发的感染发生频率高,且难以诊断和治疗。目前,传统的细菌检测方法,如培养基培养技术、酶联免疫吸附试验(ELISA)和聚合酶链反应(PCR)分析等耗时长,而且缺乏足够的分辨率和实用性,不能明确区分细菌感染,更不能准确鉴定感染细菌的性质或种类。因此,亟需开发一种特异性强、性质稳定并可以直接靶向侵入细菌的临床成像工具。万古霉素是一种糖肽类抗生素,临床上常用来治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)等革兰阳性菌的感染。其抗菌原理是与革兰阳性菌细胞壁上的肽聚糖前体的五肽末端的D-丙氨酰-D-丙氨酸结合,抑制细菌细胞的合成,导致细菌死亡。但随着万古霉素的广泛使用,耐万古霉素金黄色葡萄球菌及耐万古霉素肠球菌的出现,给临床治疗带来极大困难。丹磺酰氯(DNSCl)是一种强荧光剂,它能与肽链N-端α-氨基反应生成丹磺酰-肽,从而产生荧光。本研究通过丹磺酰氯与万古霉素、万古霉素衍生物LYWW01的肽链N-端α-氨基反应生成DNSCl-vancomycin(DV)和DNSCl-LYWW01(DN01),对万古霉素进行特异性荧光标记,通过改变反应条件(温度、p H、溶剂等),得到一种高产率的制备方法;利用半制备液相色谱纯化反应溶液,再经UPLC-MS分析,确定目标产物;进而利用荧光全波段扫描绘制的荧光发射光谱,确定目标产物荧光波长范围。通过荧光酶标仪、荧光显微镜和细胞流式仪检测DV、DN01与四种临床常见的细菌结合的荧光强度,并将细菌和荧光探针注射到斑马鱼体内观察感染部位荧光的蓄积量,研究荧光标记产物的活性、毒性和稳定性;利用荧光探针研究万古霉素的抗菌机制。本研究获得以下结果:一、荧光探针的合成与性质表征的研究:在p H=9.6的条件下,万古霉素和丹磺酰氯丙酮溶液常温避光反应12小时得到的产物产率较高;两种荧光探针荧光发射波长范围在500-600 nm之间,可用于荧光检测;两种荧光探针稳定性强;且活性与毒性没有发生明显改变,为万古霉素荧光探针的临床使用提供初步依据。二、通过荧光显微镜和细胞流式仪可以观察到荧光探针与MRSA和VSE等革兰阳性菌特异性结合,并且在斑马鱼体内可以识别出含有荧光细菌的斑点。证明DV/DN01可作为一种示踪工具快速检测患者是否感染对万古霉素敏感革兰阳性细菌。三、DN01与万古霉素耐药肠球菌(VRE)作用后的荧光强度大于DV与VRE作用后的荧光强度,证明万古霉素衍生物LYWW01对VRE有一定的抗菌作用及在万古霉素的6-氨基酸上引入万古糖胺可以提高万古霉素对耐药肠球菌的活性。四、利用DV研究万古霉素对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)是杀菌作用,而对肠球菌(VSE)是抑菌作用的机制。初步判定该机制与万古霉素对两种细菌的结合率有关。综上,荧光标记的万古霉素与LYWW01没有改变其与细胞靶点的结合和药物的活性与毒性,可以对万古霉素敏感细菌进行简单、快速、灵敏和选择性的鉴定,对临床用药具有重要的指导意义,对万古霉素抗菌机制的研究提供新思路。
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