论文部分内容阅读
研究目的： 研究II型cGMP依赖性蛋白激酶（Type II cGMP dependent protein kinase, PKG II）对人胃癌细胞血管内皮生长因子受体2（Vascular endothelial growth factor receptor2, VEGFR2）介导的主要信号转导通路及生物学效应的影响，探讨其相关的分子机制。 研究方法： 用编码PKG II cDNA的腺病毒（Ad-PKG II）感染胃癌细胞株HGC-27和AGS细胞，使其高表达PKG II，并用特异性激动剂8-pCPT-cGMP激活PKG II，用血管内皮生长因子-A（vascular endothelial growth factor A, VEGF-A）激活VEGFR2，进行如下检测：采用Western Blot方法检测相关蛋白表达和磷酸化水平；采用MTT法、Transwell法、Annexin V-FITC/PI法和Matrigel血管生成实验分别检测细胞增殖、迁移、凋亡及新生血管形成；采用免疫共沉淀法检测PKG II与VEGFR2之间的相互作用；采用免疫沉淀法联合Western Blot法检测PKG II对VEGFR2丝/苏氨酸的磷酸化作用；采用位点突变法将VEGFR2的393位苏氨酸（Thr393）、439位苏氨酸（Thr439）和1231位丝氨酸（Ser1231）突变成丙氨酸，进而研究PKG II作用于VEGFR2的特异性磷酸化位点。 研究结果： 1. PKG II阻断VEGF-A引起的胃癌细胞VEGFR2酪氨酸磷酸化/活化，并抑制VEGF-A/VEGFR2介导的ERK1/2、MEK、Akt和mTOR的磷酸化/活化。 2. PKG II抑制VEGF-A的促细胞增殖、迁移和血管生成作用及抗细胞凋亡作用。 3. PKG II与VEGFR2相互结合，使其发生丝/苏氨酸磷酸化。 4. PKG II磷酸化VEGFR2的Thr439和Ser1231位点，进而阻断VEGF-A对VEGFR2的激活。 研究结论： PKG II通过结合VEGFR2并使其Thr439和Ser1231位点发生磷酸化，进而阻断VEGF-A对VEGFR2的激活，抑制VEGF-A/VEGFR2启动的信号转导，最终抑制 VEGF-A/VEGFR2诱导的胃癌细胞的增殖和迁移；PKG II对VEGF-A/VEGFR2诱导的新生血管形成也有抑制作用，并拮抗VEGF-A/VEGFR2的抗凋亡效应。结果初步阐明PKG II为一有效的抗癌因子。