生物不对称催化中酶立体选择性的定向调控

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生物催化法由于具有立体选择性强、反应条件温和、环境友好等优点而深受青睐,酶立体选择性的定向调控在生物催化中具有重要意义。通过对酶不对称催化选择性的定向调控,可以控制反应进行的方向与程度,获得高光学纯度的、具有特殊结构的目标产物。本文以磷脂酶B(PLB)和氧化还原酶为研究对象,探讨其立体选择性的定向调控策略,主要研究结果如下:(1)对菌株Candida albicans MYA-2876产磷脂酶B的发酵条件进行了优化,确定了最适发酵温度30℃,初始pH6.5,接种量为8%,培养时间为72h。初始纯化酶条件为30%浓度饱和硫酸铵,80%浓度沉淀目的蛋白,经过透析得到浓缩酶液,酶活可达201.36U/mg-protein。(2)考察了Candida albicans MYA-2876PLB的酶学性质,结果表明其最适反应温度是30℃,最适pH为7.8。温度与pH对酶活影响较大,0.1mM Mg2+与Ca2+对酶活有促进作用,分别提高了23.5%与18.8%,PLB对卵磷脂乳化液的底物适应性较好。(3)考察反应条件(反应温度、pH以及金属离子)、介质工程(有机溶剂、离子液体、两相体系)、化学修饰与固定化酶对磷脂酶B的催化位点选择性的影响。结果表明,离子液体对磷脂酶B的催化位点选择性的调控效果较好,在[Omim][D-HL]作用下磷脂酶B的Sn-1位点催化选择性CSS1得到较大提高(接近100%),而在[Emim]Cl作用下Sn-2位点催化选择性CSS2提高到47.08%;两相体系对磷脂酶B的催化位点选择性的调控效果一般,对产率影响较大,大部分相比水相提高3倍以上。正己烷-水(体积比1:1)两相系统CSS1提高最大至84.78%,2-庚醇-水(体积比1:1)两相系统CSS2提高最大至43.77%。(4)考察了乙醇脱氢酶ADH-A3263,ADH-A7011以及大肠杆菌重组酮还原酶E-Ketoreductase与八个底物2-辛酮、2-庚酮、苯乙酮、1-苯丙酮、1-苯乙醇、1-苯丙醇、2-庚醇和2-辛醇间的酶催化反应。结果表明,此三种酶均在30℃到35℃时酶活较高;ADH-A3263、ADH-A7011酶活最适pH偏碱性,E-Ketoreductase酶活最适pH偏中性;利用自动旋光仪测旋光率通过考察反应温度与pH,初步筛选出更合适的酶催化底物苯乙酮、1-苯丙酮、1-苯乙醇1-苯丙醇。(5)考察反应系统(反应温度、pH以及金属离子)、介质工程(有机溶剂、离子液体、两相体系)、酶的化学修饰、固定化酶以及辅酶再生对氧化还原酶的对映体选择性的影响。结果表明,本实验中有机溶剂对E-Ketoreductase催化1-苯丙酮的对映体选择性调控有较好效果,在异辛烷(含水量1%)中反应S型对映体选择率(E)高达30.885,而在正己烷(含水量1%)中反应时却为R型选择性,E值为3.207;离子液体对E-Ketoreductase催化1-苯丙酮的对映体选择性调控有十分明显的效果,产物发生构象翻转,反应体系添加[Emim][HL]后R型E值为6.769,而添加[Bmim]PF6时却为S型选择性,E值高达到200以上;两相体系对E-Ketoreductase催化1-苯丙酮的对映体选择性调控有很好的效果,且与有机溶剂体系相比,转化率普遍都有一定提高,在异辛烷-水(体积比1:1)中反应S型对映体选择率E最大达到333.448,而在辛酸乙酯-水(体积比1:1)中反应时R型E最大达到7.890。
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