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从卵泡发育到排卵需经过十分复杂的生理过程,此过程受内分泌激素、免疫调节和代谢信号等多种复杂因素共同调节。目前其相关过程的分子机制研究仍然比较有限。课题组前期对大白猪和太湖猪的排卵前卵泡组织进行了转录组测序,鉴定出2675个差异表达的基因。其中干扰素诱导的跨膜蛋白1(Interferon-induced transmembrane protein 1,IFITM1)在两个猪种间表达差异极显著,差异表达倍数为3.174。故本研究以IFITM1基因为研究对象,以小鼠卵巢颗粒细胞为研究模型,利用RNAi和超表达等方法,通过细胞原代培养、转染、qRT-PCR、Western blot、ELISA、EDU染色、MTT实验、CCK-8实验和流式细胞术等技术,研究IFITM1基因在卵泡发育与排卵中的功能及相关分子调控机制。主要研究结果如下:1.IFITM1基因在卵泡排卵过程中的作用(1)IFITM1基因影响排卵标记基因表达及分子机制在小鼠卵巢颗粒细胞(mouse granulosa cells,mGCs)中,通过qRT-PCR和Western blot等方法表明干扰IFITM1基因的表达可以显著促进排卵标记基因LHR、AREG、EREG和Cyp19a1的表达;补偿实验表明,过表达IFITM1基因能显著抑制排卵标记基因LHR和Cyp19a1的表达。在mGCs中,加入3种调控卵泡发育或排卵的重要细胞信号通路(ERK1/2、TGF-β和PI3K/AKT)的抑制剂阻断相应的细胞信号通路后检测排卵相关标记基因。qRT-PCR结果显示,阻断ERK1/2或TGF-β细胞信号通路后抑制表达IFITM1基因,排卵标记基因EREG、LHR的mRNA水平仍有显著上升;阻断PI3K/AKT信号通路后抑制表达IFITM1基因,排卵标记基因LHR、Cyp19a1和EREG的mRNA水平则未出现明显改变。同时Western blot结果显示,抑制表达IFITM1基因后,PI3K/AKT信号通路上关键蛋白p-AKT(Ser473)的蛋白质水平显著降低。以上结果表明,IFITM1基因通过PI3K/AKT细胞信号通路活性影响排卵标记基因的表达。(2)IFITM1基因影响卵巢颗粒细胞分泌孕酮在mGCs中,超表达或抑制表达IFITM1基因后运用qRT-PCR方法检测孕酮及其受体合成关键基因的表达水平。结果显示,超表达IFITM1基因,孕酮受体基因PGR的mRNA水平显著升高;抑制表达IFITM1基因,孕酮受体基因PGR的mRNA水平显著降低,孕酮合成关键基因3β-HSD,StAR mRNA表达水平显著升高。在mGCs中,转染pCMV-HA-IFITM1或siRNA-IFITM1后运用ELISA方法检测细胞上清中的孕酮的浓度,结果表明:超表达IFITM1基因,孕酮的浓度未出现明显变化,抑制表达IFITM1基因,显著降低孕酮的浓度。以上结果表明,IFITM1基因能影响小鼠卵巢颗粒细胞分泌孕酮,并影响颗粒细胞孕酮受体的合成。2.IFITM1基因影响卵巢颗粒细胞周期与细胞增殖通过流式细胞术检测IFITM1基因对卵巢颗粒细胞周期的影响,结果显示,相比于对照组,超表达IFITM1基因后,卵巢颗粒细胞周期S期细胞比例显著降低,抑制表达IFITM1基因,卵巢颗粒细胞周期G0/G1期的细胞比例显著降低。qRT-PCR结果显示,超表达IFITM1基因,细胞周期蛋白CCNA2和CCND1 mRNA的表达水平显著升高;抑制表达IFITM1基因,CCND1的mRNA水平显著降低。在颗粒细胞中,运用EDU染色实验、CCK-8实验和MTT实验来检测细胞增殖的变化。实验结果显示:与对照组相比,IFITM1的表达受到抑制,颗粒细胞增殖的比例显著降低。综上所述,得出结论:(1)IFITM1基因影响卵巢颗粒细胞分泌孕酮,并通过影响PI3K/AKT信号通路活性影响卵泡排卵;(2)IFITM1基因通过调控细胞周期调控因子CCND1的表达影响卵巢颗粒细胞周期;IFITM1基因能调节卵巢颗粒细胞增殖。