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目的：DNA聚合酶δ(polymerase delta, Pol δ)是真核生物DNA复制最重要的DNA聚合酶之一,它由四个亚基组成,其中催化亚基p125同时具有聚合酶和外切酶功能。P125的编码基因为POLD1。癌细胞的生长需要大量DNA的复制。POLD1基因在经典理论中被认是“管家基因”,是相对保守的,不变的。然而,癌细胞的DNA可不同于正常细胞而大量复制的现象与此理论相悖。那么,是否由于癌细胞中的POLD1基因是否发生了突变才导致了其DNA大量复制呢?为此,本研究运用DNA测序技术检测人肝癌细胞SMMC-7721的POLD1基因CDS区突变情况,了解所检测到的突变位点对POLD1基因编码的p125蛋白空间结构的影响。然后,通过构建表达人肝癌细胞SMMC-7721的POLD1基因CDS区真核质粒并转染正常肝细胞HL—7702,检测细胞增殖速率的改变,分析突变的POLD1基因对正常肝细胞增殖速率的影响,其能否使正常细胞“癌变”。由此探讨最重要的DNA复制酶的编码基因POLD1的突变与癌细胞恶性增殖的关系,进而为阻断细胞癌变提供新的思路。方法：1.用RNA提取试剂盒提取人肝癌细胞SMMC-7721的总RNA然后进行逆转录,以逆转录产物cDNA为模板运用PCR技术扩增POLD1基因CDS区。将PCR扩增产物用T载体克隆后,转化进感受态细胞并培养。最后提取包含人肝癌细胞SMMC-7721的POLD1基因CDS区序列的T载体质粒,使用载体通用引物进行DNA序列分析。2.使用NCBI (National Center for Biotechnology Information)的在线比对工具(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_P ROGRAMS=megaBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&LINK_LO C=blasthome)将方法1中测序得到的人肝癌细胞SMMC-7721的POLD1基因CDS区序列与NCBI数据库中的序列进行比对找出其中的突变位点。通过InterProScan工具(http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/)所得到的正常p125蛋白的功能域,找出突变位点在p125蛋白功能域上的定位。然后再应用SWISS-MODEL蛋白空间结构模拟工具(http://swissmodel.expasy.org/workspace/index.php?func=modellin g_simplel)模拟正常的p125及突变后的p125的蛋白空间结构,观察突变前后p125蛋白空间结构是否有差别。3.将含有人肝癌细胞SMMC-7721的POLD1基因CDS区序列的T载体质粒酶切、回收纯化后与真核表达载体pEGFP—C1连接,转化后筛选阳性克隆,得到表达人肝癌细胞SMMC-7721的POLD1基因CDS区的重组质粒GFP—POLD1。4.将转染试剂Lipofectmine2000与质粒以5：2的比例混合(转染重组质粒GFP—POLD1的为实验组,转染空载体pEGFP—C1的为阴性对照组,未作任何处理的为空白组)。室温孵育15min后均匀滴入培养有正常肝细胞HL—7702的孔板,6h后更换完全培养基。一部分细胞于48h收获,另一部分培养5d后接种于六孔板,每孔加入终浓度为500g/ml的G418抗生素进行筛选,3周后得到稳定转染的细胞。5.将上一步中稳定转染的HL—7702细胞接种于96孔板中,分别于0、24、48、72h后采用CCN—8法检测转染重组质粒GFP—POLD1的实验组HL—7702细胞、转染空载体pEGFP—C1的阴性对照组HL—7702细胞以及未作任何处理的空白组HL—7702细胞的OD490值,绘制生长曲线。6.用RNA提取试剂盒提取方法3中48h后收获的转染重组质粒GFP—POLD1的实验组HL—7702细胞、转染空载体pEGFP—C1的阴性对照组以及未作任何处理的空白组HL—7702细胞的总RNA,逆转录为cDNA后以此为模板进行荧光定量PCR,采用比较Ct值SYBR Green染料法,设置GAPDH为内参基因,检测不同组细胞中POLD1基因的表达,结果用Life Technologies StepOne Softwarev2.2分析。7.用Western Blot(蛋白质印迹)法检测方法3中72h后收获的转染重组质粒GFP—POLD1的实验组HL—7702细胞、转染空载体pEGFP—C1的阴性对照组以及未作任何处理的空白组HL—7702细胞的总蛋白中p125蛋白的表达量,设置GAPDH为内参,使用LI一COR Odyssey红外荧光扫描成像系统扫描,Odyssey v3.0软件分析数据。结果：1.成功扩增了人肝癌细胞SMMC一7721的POLD1基因CDS区,并将其用pMD19一T Simple Vector克隆,产物测序得到其序列。2.经过与NCBI数据库中的序列比对,发现人肝癌细胞SMMC一7721的POLD1基因CDS区中共有11个碱基置换突变,其有9个是沉默突变,并不引起编码氨基酸的改变,2个是错义突变,引起编码氨基酸的改变。通过InterProScan分析正常p125蛋白的功能域后,发现突变的POLD1基因中的2个错义突变是在p125蛋白的3’—5’核酸外切酶功能域中。同时,通过SWISS—MODEL模拟正常p125及突变后的p125蛋白的空间结构,发现突变的p125蛋白空间结构发生了明显改变。3.成功构建了表达人肝癌细胞SMMC一7721的POLD1基因CDS区的真核表达载体GFP—POLD1,将其转染进正常肝细胞HL—7702中后可以观察到细胞内出现绿色荧光。4.CCK—8实验结果表明转染重组质粒GFP—POLD1后的实验组HL—7702细胞、转染空载体pEGFP—C1的阴性对照组HL—7702细胞及不作任何处理的空白组HL—7702细胞三者吸光度OD490在接种后0h差异无统计学意义(P>0.05),但在24h、48h及72h的差异具有统计学意义(P<0.05)。转染重组质粒GFP—POLD1的实验组HL—7702细胞的增殖速度显著高于不作任何处理的空白组HL—7702细胞及转染空载体pEGFP—C1的阴性对照组HL—7702细胞。5.荧光定量PCR实验从mRNA水平证实了转染了重组质粒GFP—POLD148h后的实验组HL—7702细胞中POLD1基因的表达量明显高于转染空载体pEGFP—C1及未作任何处理的HL—7702细胞中POLD1基因的表达量(P<0.05)。6.蛋白质印迹(Western Blot)实验证明转染重组质粒GFP—POLD1的HL—7702细胞中p125蛋白的表达量明显高于转染空载体pEGFP—C1及未作任何处理的HL—7702细胞中p125蛋白的表达量(P<0.05)。结论：1.通过对人肝癌细胞SMMC一7721的POLD1基因CDS区突变的分析,发现p125蛋白3’—5’核酸外切酶功能域中的2个氨基酸发生改变,影响了p125蛋白的空间结构及其所具有的功能活性。2.细胞系实验证实了转染人肝癌细胞SMMC一7721的POLD1基因CDS区后,正常肝细胞HL—7702的POLD1基因及其编码的p125蛋白表达升高,细胞增殖速度加快,提示POLD1基因自身的突变有可能导致癌细胞中DNA聚合酶δ异常调控,以满足癌细胞大量增殖所需的原因。