目的：神经母细胞瘤来源于原始神经嵴,是一种较常见的婴儿和儿童颅外实体肿瘤,占小儿肿瘤病死率的15%。MYC基因家族(c-myc, MYCN and Mycl)属于癌基因中的核蛋白类调控基因,其基因产物MYC蛋白在许多肿瘤中存在着异常表达。MYC基因家族及其产物在细胞增殖、永生化、去分化及转化和诱导凋亡等多方面起到调节作用,在多种肿瘤形成过程中处于重要地位。癌基因MYCN异常扩增是判断神经母细胞瘤预后的重要指标之一,MYCN扩增和肿瘤的恶性分期、进展速度、耐药性等有高度相关性,因此MYCN基因被认为是神经母细胞瘤药物及基因治疗的重要靶点。RUNX3是转录因子Runt家族成员之一。该基因家族在哺乳动物生长过程中扮演重要角色,近来的研究表明,RUNX3在多种肿瘤,包括胃癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、胆管癌等的发生、发展过程中都表现出了抑癌基因功能。我们之前的临床样本分析显示RUNX3高表达与神经母细胞瘤患者的良好预后密切相关,表现出了肿瘤抑制基因的活性。本实验目的旨在从生化和分子生物角度验证RUNX3基因在神经母细胞瘤中的抑癌功能,对此,我们采用多种实验方法,测定了RUNX3对MYCN的负向调节作用,并分析了此调节作用的分子生物学机制。方法：本研究选用MYCN扩增的人类神经母细胞瘤细胞系SK-N-BE、NLF和MYCN未扩增的人类神经母细胞瘤细胞系SY5Y、SK-N-AS以及人胚胎肾上皮细胞HEK293,通过克隆形成实验分析RUNX3过表达对不同神经母细胞瘤的增殖抑制作用；使用RT-PCR和Western blot方法研究在RUNX3转染细胞系中,MYCN转录水平和蛋白质水平的变化；通过泛素化实验,研究神经母细胞瘤细胞系中,RUNX3基因对于MYCN蛋白降解途径的影响；最后又运用免疫沉降和GST-pull down的方法,分析细胞内和细胞外MYCN和RUNX3蛋白质水平的相互作用。结果：1克隆形成实验结果：在三种神经母细胞瘤细胞系中转染不同量的pcDNA3-RUNX3表达质粒(0μg,0.5μg,1μg,2μg),48 h后用G418(800μg/ml)筛选,2周后用姬姆萨染液对细胞进行染色。结果显示在MYCN扩增和未扩增的神经母细胞瘤细胞中,RUNX3基因均有抑制肿瘤细胞扩增作用。2转染外源性pcDNA3-RUNX3表达质粒抑制MYCN的蛋白表达水平,但是对其mRNA表达水平没有影响。2.1在MYCN扩增的神经母细胞瘤细胞系SK-N-BE和NLF中转染外源性pcDNA3-RUNX3表达质粒,转染后48 h收集细胞分别进行western和PCR实验检测MYCN蛋白和mRNA的表达,结果显示内源性MYCN蛋白随着pcDNA3-RUNX3表达质粒转染量(0μg,2μg,4μg)的增加而降低。但是MYCN的mRNA表达水平没有受pcDNA3-RUNX3的影响。2.2在MYCN扩增的神经母细胞瘤细胞系SK-N-BE转染外源性pcDNA3-RUNX3表达质粒,在转染后不同的时间段(0h,12h,18h,24h,30 h)收集细胞进行,用western-blot实验检测MYCN蛋白的表达。结果显示在蛋白水平MYCN表达量随RUNX3表达量增高而降低。2.3在MYCN扩增的神经母细胞瘤细胞SK-N-BE中转染pcDNA3-RUNX3表达质粒,24 h后RUNX3转染组与未转染组均用蛋白合成抑制剂cycloheximide(CHX 50μg/ml)处理,并在处理后不同的时间段收集细胞(0 h,0.5 h,1 h,1.5 h,2 h),用western-blot实验检测MYCN蛋白的表达。在RUNX3未转染组MYCN蛋白半衰期为27 min,在RUNX3转染组MYCN蛋白的半衰期为18 min。由此提示RUNX3可以促进MYCN的蛋白质降解。2.4在MYCN扩增的神经母细胞瘤细胞SK-N-BE中转染pcDNA3-RUNX3表达质粒,免疫荧光实验结果显示,外源性RUNX3(红色)抑制MYCN(绿色)蛋白在细胞核(蓝色)的定位。3在SK-N-BE和NFL细胞转染外源性pcDNA3-RUNX3表达质粒,并使用蛋白酶体抑制剂MG132(10μg/ml)处理细胞,同时设立未处理组作对照。MG132处理4h后收集细胞,用western-blot实验检测MYCN蛋白的表达。结果显示在MG132未使用组,RUNX3抑制MYCN的蛋白表达,在MG1 32使用组RUNX3对MYCN蛋白表达没有抑制作用。4 UNX3和MYCN的蛋白相互作用4.1外源性免疫共沉降结果显示,外源性的RUNX3蛋白与MYCN蛋白在HEK293细胞中存在蛋白相互作用。4.2内源性免疫共沉降结果显示,内源性的RUNX3蛋白与MYCN蛋白在SK-N-BE细胞存在蛋白相互作用。4.3细胞外GST-pull down结果分析说明Runt结构域是RUNX3与MYCN结合的主要区域。4.4免疫荧光染色实验表明外源性RUNX3和MYCN蛋白在HEK293细胞定位于细胞核内,并存在蛋白相互作用。5在SK-N-BE细胞中共转染pcDNA3-RUNX3表达质粒和His-ubiquitin质粒,并使用NiT beads进行沉降,泛素化实验结果显示RUNX3可以促进MYCN蛋白的多泛素化过程。结论：1在MYCN扩增和未扩增的神经母细胞瘤细胞中,RUNX3均有抑制肿瘤细胞增殖作用。2 RUNX3抑制MYCN的蛋白表达水平,但是对其mRNA表达水平没有影响。3 RUNX3对MYCN蛋白水平降解作用依赖于蛋白酶体功能。4 RUNX3和MYCN存在蛋白相互作用。5 RUNX3可以促进MYCN蛋白的多泛素化降解过程。综上所述,抑癌基因RUNX3在神经母细胞瘤中的抑癌机制可解释如下：即促进MYCN癌蛋白的泛素化降解从而抑制其癌基因功能,并且此降解作用可能与RUNX3与MYCN在蛋白水平的相互结合有关。