抗性与敏感烟粉虱P450基因克隆及序列分析

来源 :福建农林大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:huangjl41
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细胞色素P450单加氧酶( P450酶系)是生物体内一种多酶复合体。细胞色素P450是一类以还原态与CO结合后在波长450nm处有吸收峰的单链蛋白质,是整个酶系中的末端氧化酶,它即负责活化氧分子,同时还有与底物结合的作用,并决定酶系底物的专一性,在整个酶系功能中起着重要的作用。它于1958年被发现以来,由于它对许多内源性和外来物质都有代谢作用,所以广泛地引起了人们的重视。细胞色素P450的作用涉及到昆虫的生长,发育,取食等生理、生化过程,主导昆虫对杀虫剂的抗药性的形成和提高对植物有毒物质耐受性,在植食性昆虫与植物的协同进化进程中,细胞色素P450起了重要的作用。在分子水平上研究昆虫的细胞色素P450,可以深层次了解其作用机理。烟粉虱Bemisia tabaci属同翅目粉虱科粉虱亚科原产于热带和亚热带地区.近年来随着花卉和其它植物苗木的调运在世界各地广泛传播并爆发成灾,该虫为多食性害虫主要危害包括吸取植物汁液,分泌蜜露影响植物的光合作用,同时也是传播多种植物病毒的祸手,给农业生产造成了巨大的经济损失。本论文以福建省福州地区田间抗性烟粉虱以及经过室内选育的相对敏感烟粉虱为研究对象,先研究田间与室内选育烟粉虱对3种不同杀虫剂抗性差异,接着鉴定了实验用烟粉虱生物型,并对烟粉虱细胞色素P450基因进行了克隆和序列分析,为深入了解烟粉虱细胞色素P450的结构与功能,为烟粉虱的防治与综合治理提供理论参考。主要研究结果如下:1.研究了3种不同种类杀虫剂对田间抗性与室内选育敏感烟粉虱成虫的毒力检测。实验证明了田间烟粉虱比经过室内选育的烟粉虱具有更强的抗药能力。2.利用mtDNA CO I基因片段作标记,采用序列分析的方法对实验用烟粉虱进行生物型鉴定,结果表明试验用烟粉虱属于B型。3.利用根据与亚铁血红素结合保守序列设计的简并引物的,以田间抗性烟粉虱的cDNA为模板,得到252bp的片段,编号为100。采用3′和5′RACE技术,以克隆到片段的序列信息为基础,设计特异引物GSP与通用引物AUAP扩增该片段的3′和5′端,分别得到436bp与519bp面个片段,分别编号为101,102;经过以上三个序列拼接得到一段1002bp的基因片段,其中包括包括终止密码子TAA,推导的氨基酸序列具有细胞色素P450的保守序列PFXXGXXXC和在K螺旋中公认的“meander”-折叠序列(EXXR and PXRF),可以知道此序列为P450基因片段,进一步与已知P450基因序列比对,可推定此基因片段为CYP6家族基因。4.由103序列设计一对特异引物,将从田间抗性烟粉虱以及经过室内选育的相对敏感烟粉虱中提取的总RNA先进行逆转录(RT),得到抗性和敏感逆转录反应产物后再使用设计的上下游引物进行PCR扩增,均获得641bp的片段,编号105,106。由105,106核苷酸推导出氨基酸序列编号为107,108。经过107与108氨基酸序列分析比较发现有2个氨基酸残基有区别,这两个氨基酸转换会不会对烟粉虱抗性产生影响,还有待进一步实验进行验证。
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